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1、叶绿体色素的提取理化性质与含量测定 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望提取叶绿体色素提取叶绿体色素分析叶绿素的物理、化学性质分析叶绿素的物理、化学性质测定叶绿素的含量测定叶绿素的含量提提取取和和测测定定植植物物组组织织中中的的光光合合色色素素是是研研究究光光合合作用机理的重要技术手段作用机理的重要技术手段。1.实验目的及意义实验目的及意义 2.1 2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿素用含水的有机溶剂提取叶绿素2.实验原理实验原理 亲亲水水的的“头头部部”
2、：镁镁原原子子居居于于卟卟啉啉环环的的中中央央，带带正正电电性性，与与其其相相联联的的氮氮原原子子则则偏偏向向于于带带负负电电性性，因因而而卟卟啉啉具具有有极极性性，是亲水的，可以与蛋白质结合。是亲水的，可以与蛋白质结合。亲亲脂脂的的“尾尾巴巴”：叶叶绿绿醇醇是是由由四四个个异异戊戊二二烯烯单单位位组组成成的的双双萜萜，是是一一个个亲亲脂脂的的脂脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。纯纯的的有有机机溶溶剂剂不不能能打打破破叶叶绿绿体体色色素素与与蛋蛋白白质质的的联联系系，所所以以必必须须用用能能与与水水混混溶溶的的有有机机溶溶剂剂并并有有少少量量水水存存在在时时，才才能
3、能将将叶绿体色素提取出来。叶绿体色素提取出来。80%80%丙酮丙酮95%95%乙醇乙醇丙酮丙酮:乙醇乙醇:水水(4.5:4.5:1)(4.5:4.5:1)2.2 2.2 叶绿素的物理性质叶绿素的物理性质1 1）叶绿素的吸收光谱）叶绿素的吸收光谱红光区：红光区：640660 nm篮紫光区：篮紫光区：430450 nm胡胡萝萝卜卜素素和和叶叶黄黄素素：400500 nm不用蓝光区测不用蓝光区测叶绿素含量。叶绿素含量。2 2）荧光现象）荧光现象叶叶绿绿素素溶溶液液在在透透射射光光下下呈呈绿绿色色，而而在在反反射射光光下下呈呈红红色的现象。色的现象。2.3 2.3 叶绿素的化学性质叶绿素的化学性质叶叶
4、绿绿素素是是叶叶绿绿酸酸的的酯酯（叶叶绿绿酸酸是是双双羧羧酸酸，其其中中一一个个羧羧基基被被甲甲醇醇酯酯化，另一个被叶绿醇酯化）。化，另一个被叶绿醇酯化）。叶叶绿绿素素可可以以与与碱碱起起皂皂化化反反应应而而生生成成醇醇（甲甲醇醇和和叶叶绿绿醇醇）和和叶叶绿绿酸酸的的盐盐，产产生生的的盐盐能能溶溶于于水水中中，用用此此法法可可将将叶叶绿绿素素与与类类胡胡萝萝卜卜素素分分开。开。1 1）皂化反应）皂化反应皂化分层叶绿酸的盐形成以后，因分子极性增大，易溶叶绿酸的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能进入苯层；于稀酒精溶液中，不能进入苯层；而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中；而类
5、胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中；一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳白色的溶液。白色的溶液。低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。2 2）取代反应）取代反应卟啉环中的卟啉环中的Mg处于不稳定的状态，可被处于不稳定的状态，可被H+、Cu2+、Zn2+等离子取代。等离子取代。稀稀酸酸：叶叶绿绿素素溶溶液液与与稀稀酸酸作作用用，Mg可可以以被被H+所所取取代代而而成成褐褐色色的的去去镁镁叶叶绿绿素素，去去镁镁叶叶绿绿素素遇遇Cu2
6、+则则成成为为深深绿绿色色的的铜铜代代叶叶绿绿素素，铜铜代代叶叶绿绿素素很很稳稳定定，在光下不易破坏（在光下不易破坏（常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）。常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）。浓浓酸酸：叶叶绿绿素素溶溶液液与与浓浓酸酸作作用用，Mg被被H+取取代代，且且生生成成的的去去镁镁叶叶绿绿素素迅迅速速分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色。分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色。1 1）吸收光谱）吸收光谱 红光区：红光区：640660 nm；篮紫光区：；篮紫光区：430450 nm。2 2）荧光现象）荧光现象 叶绿素溶液在透射光下呈叶绿素溶液在透射光下呈绿色绿色，而在反射光下呈，而在
7、反射光下呈红色红色。3 3）皂皂化化反反应应 叶叶绿绿素素是是叶叶绿绿酸酸的的酯酯，可可与与碱碱起起皂皂化化反反应应而而生生成成醇醇和和叶叶绿绿酸酸的的盐盐，产产生生的的盐盐能能溶溶于于水水中中，用用此此法法可可将将叶叶绿绿素素与与类类胡胡萝萝卜卜素素分开。分开。4）取取代代反反应应 在在稀稀酸酸中中，叶叶绿绿素素中中的的镁镁可可以以被被H+所所取取代代而而成成褐褐色色的的去去镁镁叶叶绿绿素素，后后者者遇遇Cu2+则则成成为为绿绿色色的的铜铜代代叶叶绿绿素素，铜铜代代叶叶绿绿素素很很稳稳定定，在在光光下下不不易易破破坏坏。在在浓浓酸酸中中，叶叶绿绿素素中中的的Mg被被H+取取代代，且且生生成的
8、成的去镁叶绿素去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈迅速分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色褐绿色。5）叶叶绿绿素素的的化化学学性性质质很很不不稳稳定定，容容易易受受强强光光的的破破坏坏，特特别别是是当当叶叶绿绿素素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素的理化性质叶绿素的理化性质 1）叶叶绿绿素素a、b分分别别在在665nm和和649nm波波长长处处（95%乙乙醇醇提提取取）有有最最大大的的吸吸收收峰峰，同同时时在在该该波波长长处处叶叶绿绿素素a，b的的比比吸吸收收系系数数K为为已已知知，我我们们即即可可以以根根
9、据据Lambert-Beer定律，列出以下关系式：定律，列出以下关系式：Ca=13.95A665 6.88 A649 Cb=24.96 A649 7.32 A665 CT=Ca+Cb=18.08 A649+6.63A665A665和和A649为叶绿素溶液在波长为叶绿素溶液在波长665 nm和和649 nm时的吸光度时的吸光度Ca、Cb、CT分别为叶绿素分别为叶绿素a、b及总的浓度，以及总的浓度，以mgL-1为单位为单位 2）叶绿素）叶绿素a、b在在652 nm波长处有相同的比吸收系数（均为波长处有相同的比吸收系数（均为34.5），在此），在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，也可计算出叶绿素波长下
10、测定叶绿素溶液的吸光度，也可计算出叶绿素a、b的总浓度。的总浓度。CT=（A6521000）34.5 3）叶绿素的含量）叶绿素的含量（mg/g）=叶绿素的浓度叶绿素的浓度提取液体积提取液体积稀释倍数稀释倍数/样品样品鲜重鲜重 2.4 2.4 叶绿素含量的计算叶绿素含量的计算 3.材料、仪器设备与试剂材料、仪器设备与试剂材料：材料：菠菜叶片菠菜叶片仪器：仪器：试管、容量瓶、研钵、分光光度计、水浴锅，等。试管、容量瓶、研钵、分光光度计、水浴锅，等。试剂：试剂：石英砂、碳酸镁、石英砂、碳酸镁、95乙醇、乙醇、20%NaOH-甲醇、甲醇、苯、苯、36%乙酸、醋酸铜、浓盐酸乙酸、醋酸铜、浓盐酸1.叶绿体
11、色素提取叶绿体色素提取 称取新鲜去大叶脉的菠菜叶片称取新鲜去大叶脉的菠菜叶片3g，剪碎放入研钵中，剪碎放入研钵中，加少量石英砂和加少量石英砂和碳碳酸镁酸镁及及5ml 95乙醇，研成均浆，过滤入乙醇，研成均浆，过滤入25ml 容量瓶，分别用容量瓶，分别用5ml 95乙醇冲洗研钵乙醇冲洗研钵3次，冲洗液同样过滤，收集滤液，倒入容量瓶中，最后用次，冲洗液同样过滤，收集滤液，倒入容量瓶中，最后用95乙醇定容至乙醇定容至25ml，放入暗处备用。，放入暗处备用。2.叶绿素的荧光现象叶绿素的荧光现象 取取叶叶绿绿素素提提取取液液2ml放放入入试试管管中中，在在直直射射光光下下观观察察溶溶液液的的透透射射光光
12、及及反反射射光光的颜色有何不同？的颜色有何不同？（结果与分析（结果与分析1）3.光对叶绿体色素的破坏作用光对叶绿体色素的破坏作用 取取两两支支试试管管，各各加加入入叶叶绿绿体体色色素素提提取取液液2ml，一一管管放放在在直直射射光光下下，另另一一管管放在黑暗处，放在黑暗处，12 h后观察两管溶液颜色有何变化？后观察两管溶液颜色有何变化？（结果与分析（结果与分析2）4.实验步骤实验步骤4.叶绿素的皂化作用叶绿素的皂化作用 3ml提取液提取液+1ml 20%NaOH-甲醇（摇匀）甲醇（摇匀）冷却冷却 +3ml苯（摇匀）苯（摇匀）+3ml蒸馏水（逐滴加，摇匀）蒸馏水（逐滴加，摇匀）静置，观察分层现象
13、。静置，观察分层现象。下下层层是是稀稀的的乙乙醇醇溶溶液液，其其中中溶溶有有皂皂化化的的叶叶绿绿素素a和和b（以以及及少少量量的的叶叶黄黄素素）；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。对照：对照：另取另取3ml 叶绿体色素提取液，加入叶绿体色素提取液，加入2ml 苯和苯和2ml 蒸馏水观察与皂化的蒸馏水观察与皂化的叶绿素有何不同？叶绿素有何不同？（结果与分析（结果与分析3）60水浴水浴 3min5.H+和和Cu2+对叶绿素分子中对叶绿素分子中Mg2+的取代作用的取代作用1）吸吸取取叶叶绿绿体体色色素素提提取取液液2ml放放入入试试管管中中，
14、逐逐滴滴加加入入36%乙乙酸酸数数滴滴，摇摇匀，观察溶液颜色的变化。匀，观察溶液颜色的变化。（结果与分析（结果与分析4.1）2）当当溶溶液液变变褐褐色色后后，倾倾出出一一半半于于另另一一试试管管中中，投投入入几几粒粒醋醋酸酸铜铜粉粉，水水浴浴加加热热，观观察察溶溶液液颜颜色色变变化化，与与未未加加醋醋酸酸铜铜（同同时时加加热热）的的一一管管相相比比较较。（结果与分析结果与分析4.2）3）吸吸取取叶叶绿绿体体色色素素提提取取液液2ml放放入入试试管管中中，逐逐滴滴加加入入浓浓盐盐酸酸，观观察察颜颜色色变化。变化。（结果与分析（结果与分析4.3）6.叶绿体色素含量测定叶绿体色素含量测定吸吸取取叶叶
15、绿绿体体色色素素提提取取液液5ml，用用95%乙乙醇醇定定容容至至50ml。以以95%乙乙醇醇为为空空白白对对照照，在在波波长长665nm、649nm、652nm下下测测定定吸吸光光度度，并并分分别别计计算算叶叶绿绿素素a和叶绿素和叶绿素b的浓度（的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。），二者之和为总叶绿素的浓度。最后，根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：最后，根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：叶绿素的含量（叶绿素的含量（mg/g）=叶绿素的浓度叶绿素的浓度稀释倍数稀释倍数提取液体积提取液体积 /样品鲜重样品鲜重比较两种方法所得的实验结果。比较两种方法所得
16、的实验结果。（结果与分析（结果与分析5）5.结果与分析结果与分析详见实验步骤详见实验步骤（结果与分析（结果与分析1-6）6.注意事项注意事项1）为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，）为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些，以不超过研磨时间应尽量短些，以不超过2分钟为宜。分钟为宜。2）叶绿体色素提取液不能浑浊，否则应重新过滤。）叶绿体色素提取液不能浑浊，否则应重新过滤。3）分光光度计的正确使用。）分光光度计的正确使用。1）用不含水的有机溶剂提取植物材料特别是干材料的叶绿）用不含水的有机溶剂提取植物材料特别是干材料的叶绿体色素往往效果不佳，原因何在？体色素往往效
17、果不佳，原因何在？2）研磨提取叶绿素时加入）研磨提取叶绿素时加入MgCO3，有什么作用？，有什么作用？3）叶绿素）叶绿素a、叶绿素、叶绿素b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素收峰波长进行叶绿素a、叶绿素、叶绿素b的定量分析？为什么？的定量分析？为什么？7.思考题思考题加加入入少少许许碳碳酸酸钙钙的的目目的的是是为为了了防防止止在在研研磨磨过过程程中中，叶叶绿绿素素受受到到破破坏坏。具具体体的的情情况况是是这这样样的的：叶叶绿绿体体中中的的色色素素所所处处的的环环境境具具微微碱碱性性，实实验验中中，由由于于研研磨磨会会使使细细胞胞结结构构遭遭到到破破坏坏，细细胞胞液液（具具微微酸酸性性）流流出出，酸酸性性的的细细胞胞液液就就会会直直接接接接触触叶叶绿绿体体中中色色素素，致致使使叶叶绿绿素素的的分分子子结结构构遭遭到到破破坏坏，使使叶叶绿绿素素失失镁镁，呈呈黄黄褐褐色色，所所以以加加入入少少许许碳碳酸酸钙钙是是为为了了中中和和细细胞胞液液的的酸性，可起到保护叶绿素的作用酸性，可起到保护叶绿素的作用。