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1、叶绿体色素的提取分离及叶绿体色素的提取分离及其理化性质的观察其理化性质的观察一一.实验目的实验目的 因此，测定叶绿素含量便成为研因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在生产中有着广泛的应用。在生产中有着广泛的应用。1 1.学习叶绿体色素的提取方法。学习叶绿体色素的提取方法。2 2.了解叶绿素和类胡萝卜素的一些主了解叶绿素和类胡萝卜素的一些主要理化性质。要理化性质。绿色植物的光合作用是在叶绿体色素参与下进行的，绿色植物的光合作用是在叶绿体色素参与下进行的，了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于理解光合作用了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于
2、理解光合作用的本质很有帮助。的本质很有帮助。植物色素包括：植物色素包括：脂溶性的叶绿体色素：脂溶性的叶绿体色素：存在于叶绿体，与光合作用有关，如叶绿存在于叶绿体，与光合作用有关，如叶绿素、类胡萝卜素等；素、类胡萝卜素等；水溶性的细胞液色素：水溶性的细胞液色素：存在于液泡中，与花朵的颜色有关，如花存在于液泡中，与花朵的颜色有关，如花青素属黄酮类物质。青素属黄酮类物质。二、原理与操作步骤二、原理与操作步骤（二）叶绿体色素的提取原理和方法（二）叶绿体色素的提取原理和方法 各各种种植植物物叶叶绿绿体体中中所所含含的的色色素素有有数数十十种种，可可分分三三大大类类。叶叶绿绿素素类类、类类胡胡萝萝卜卜素素
3、类类和和藻藻色色素素类类（或或称称藻藻胆胆素素类类）。后后一一类类只只存存在在于于藻藻类类。以下只介绍前两类。以下只介绍前两类。(一一).实验材料：菠菜叶片实验材料：菠菜叶片。叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a a和叶绿素和叶绿素b b，酯类化，酯类化合物）和黄色素（包括胡萝卜素（烃类）叶黄素（衍生的醇合物）和黄色素（包括胡萝卜素（烃类）叶黄素（衍生的醇类）两大类。它们与类囊体膜上的类）两大类。它们与类囊体膜上的蛋白质相结合蛋白质相结合，而成为，而成为色素蛋白复合体，色素蛋白复合体，不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机
4、溶剂提取。或丙酮等有机溶剂提取。提取的操作步骤：提取的操作步骤：乙醇提取液：乙醇提取液：（1）取取菠菠菜菜叶叶片片洗洗净净、擦擦干干、剪剪碎碎、混混匀匀，称称2g，放入研钵中。，放入研钵中。（2）加加入入少少量量石石英英砂砂及及碳碳酸酸钙钙粉粉，加加12滴滴管管95%乙乙醇醇，研研磨磨至至糊糊状状；再再加加1015ml 95%乙乙醇醇，提提取取13min，过过滤滤于于三三角角瓶瓶中中；残残渣渣用用5ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。提取的操作步骤：提取的操作步骤：水研磨匀桨：水研磨匀桨：另另取取2g2g2g2g剪剪碎碎的的新新鲜鲜叶叶片片，放放入入少少量量
5、石石英英砂砂（不不加加碳碳酸酸钙钙粉粉），用用水水研研磨磨。先先加加2ml2ml蒸蒸馏馏水水，研研至至糊糊状状，再再加加蒸蒸馏馏水水20ml20ml，搅均，不过滤。搅均，不过滤。为做光破坏准备的为做光破坏准备的乙醇提取液乙醇提取液操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤：水研磨匀浆水研磨匀浆操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤：因因吸吸附附剂剂（本本试试验验为为滤滤纸纸）对对不不同同物物质质的的吸吸附附力力不不同同，当当用用适适当当的的溶溶剂剂推推动动时时，混混合合物物中中各各成成分分在在两两相相（流流动动相相和和固固定定相相）间间具具有有不不同同的的分分配配系系数数，所所以以它它们们的的移移动动速速度度
6、不不同同，经经过过一一定定时间层析后，便将混合色素分离。时间层析后，便将混合色素分离。1.1.提取液中各成分分离：提取液中各成分分离：用色层分析的原理加以分离用色层分析的原理加以分离分配系数分配系数吸附吸附 脱吸附脱吸附 再吸附再吸附 再脱吸附再脱吸附叶叶绿绿体体色色素素的的结结构构决决定定极极性性不不同同，因因而而在在滤纸上的迁移速率不同。滤纸上的迁移速率不同。叶绿体色素叶绿体色素叶绿素叶绿素类胡萝卜素类胡萝卜素叶绿素叶绿素a a叶绿素叶绿素b b胡萝卜素胡萝卜素叶黄素叶黄素叶绿素的化学结构叶绿素的化学结构细菌叶绿素细菌叶绿素a叶绿素叶绿素a叶绿素叶绿素b卟啉卟啉卟啉卟啉植醇植醇叶绿醇叶绿醇
7、烃类烃类衍生的醇类衍生的醇类吸附剂：滤纸吸附剂：滤纸推动剂：石油醚推动剂：石油醚:丙酮丙酮:苯（苯（10:2:110:2:1）步骤：步骤：（1 1）圆形定性滤纸）圆形定性滤纸1 1张（直径张（直径11cm11cm），用细头的吸管在其中），用细头的吸管在其中 心戳一圆形小孔（直径约心戳一圆形小孔（直径约3mm3mm）。）。（2 2）另取一张滤纸条（）另取一张滤纸条（5cm1.5cm5cm1.5cm），沿纸条长度方向涂色），沿纸条长度方向涂色 素，限制在素，限制在0.5cm0.5cm，风干后，重复涂抹数次。，风干后，重复涂抹数次。沿长度方向卷成纸捻。沿长度方向卷成纸捻。涂抹色素要适量，量多拖尾，量
8、少色带看不清。涂抹色素要适量，量多拖尾，量少色带看不清。涂抹色素的技巧方法：将色素放到一块平板玻璃上，涂涂抹色素的技巧方法：将色素放到一块平板玻璃上，涂 抹纸片，这样涂抹的色带窄，分离效果好。抹纸片，这样涂抹的色带窄，分离效果好。（3 3）纸纸捻捻带带有有色色素素的的一一端端插插入入圆圆形形滤滤纸纸的的小小孔孔中中，与与滤滤纸纸平平齐（勿凸出）。齐（勿凸出）。（4 4）康维皿放置培养皿内，康维皿中央小室中加满）康维皿放置培养皿内，康维皿中央小室中加满 推动剂。推动剂。（5 5）把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸）把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸 捻下端浸入推动剂中。盖好培养皿捻下
9、端浸入推动剂中。盖好培养皿(为什么？为什么？)。（6 6）推动剂到达滤纸边缘时，取出滤纸，风干。推动剂到达滤纸边缘时，取出滤纸，风干。用铅笔标出各种色素的位置和名称。用铅笔标出各种色素的位置和名称。（7 7）剪下一部分附到实验报告中。）剪下一部分附到实验报告中。注意：注意：1 1、色素多涂抹几次，风干后再涂抹第二次。、色素多涂抹几次，风干后再涂抹第二次。细，匀，直，浓。细，匀，直，浓。2 2、涂抹的色素要适量，量多易发生拖尾，量少色带看、涂抹的色素要适量，量多易发生拖尾，量少色带看 不清；不清；3 3、纸捻卷紧；、纸捻卷紧；4 4、色素涂抹的宽度不要超过纸条的二分之一；、色素涂抹的宽度不要超过
10、纸条的二分之一；5 5、中心孔要小而圆；平齐，勿突出；、中心孔要小而圆；平齐，勿突出；6 6、分离时一定要盖严，防止推动剂蒸发。、分离时一定要盖严，防止推动剂蒸发。颜颜色色从从外外往往内内分分别别是是橙橙黄黄色色、黄黄色色、蓝绿色和黄绿色。蓝绿色和黄绿色。分别为：？分别为：？实验结果实验结果：标出各种色素名称标出各种色素名称（1 1）.光对叶绿素的破坏作用光对叶绿素的破坏作用叶绿素（叶绿素（a，b）的化学性质很不稳定，容易）的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。破坏更快，而类胡萝卜素则
11、较稳定。（提取出叶绿素后先做这一步）（提取出叶绿素后先做这一步）用用15N研究燕麦叶片中色素的合成和分解发研究燕麦叶片中色素的合成和分解发现，现，72小时全部更新一遍。小时全部更新一遍。2.2.叶绿体色素的理化性质叶绿体色素的理化性质光对叶绿素破坏的操作步骤：光对叶绿素破坏的操作步骤：稀释时不用严格定量？稀释时不用严格定量？稀释稀释2-3倍，为什么要稀释？倍，为什么要稀释？水提取液水提取液暗暗光光 乙醇提取液乙醇提取液 暗暗 光光 注注意意：色色素素乙乙醇醇提提取取液液的的浓浓度度太太大大，必必须须进进行行稀稀释释才才能能做做光光破破坏坏实实验验，稀稀释释倍倍数数视视提提取取液液的的浓浓度度确
12、确定定，浓浓度度不不要过大，否则在短时间之内效果不明显。要过大，否则在短时间之内效果不明显。光下破坏的时间不要过长，否则看不到效果。阴天可光下破坏的时间不要过长，否则看不到效果。阴天可以适当延长，时刻观察。以适当延长，时刻观察。阴天和晚上上课的同学取滤纸一张，将两种液分别涂阴天和晚上上课的同学取滤纸一张，将两种液分别涂抹在滤纸上，带回去，放在光下处理。抹在滤纸上，带回去，放在光下处理。水研磨匀浆液水研磨匀浆液乙醇提取液乙醇提取液置于光下置于光下1010分钟分钟折叠折叠剪开剪开置于暗处置于暗处 （2 2）、荧光现象）、荧光现象 叶绿素的荧光叶绿素的荧光:叶绿素酒精溶液在透射光下为翠叶绿素酒精溶液
13、在透射光下为翠绿色，在反射光下为棕红色。这红光就是叶绿素受光激绿色，在反射光下为棕红色。这红光就是叶绿素受光激发后发射的荧光。发后发射的荧光。叶绿素酒精溶液的荧光强度较强，约达其吸收光的叶绿素酒精溶液的荧光强度较强，约达其吸收光的1010左右，而鲜叶的荧光强度较低，只占其吸收光的左右，而鲜叶的荧光强度较低，只占其吸收光的0.l0.l1 1。当荧光出现后，立即中断光源，用灵敏的光学仪器当荧光出现后，立即中断光源，用灵敏的光学仪器还可在短时间内看到红色还可在短时间内看到红色“余晖余晖”，这是磷光。，这是磷光。如果提取液的浓度较低，无法观察到荧光。如果提取液的浓度较低，无法观察到荧光。叶绿素的荧光现
14、象透透透透射射射射光光光光反反射射光光如果提取液的浓度较低，无法观察到荧光。（荧光强度太弱）取一支取一支20ml刻度试管刻度试管加入加入5ml浓的浓的色素乙醇提取液色素乙醇提取液观察溶液的透射光观察溶液的透射光与反射光有何变化？与反射光有何变化？（3 3）、皂化作用）、皂化作用C32H30ONMg COOCH3 COOC20H39+2KOH C32H30ON4Mg COOK COOK+CH3OH+C20H39OH 叶绿醇叶绿醇甲醇甲醇 叶绿素是一种二羧酸叶绿素是一种二羧酸-叶绿酸与甲醇和叶绿醇形叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，可与碱起皂化反应，生成醇和叶绿酸的盐，成的复杂酯，可与碱起皂化反应
15、，生成醇和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分产生的盐能溶于水，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。开。步骤：步骤：1 1、加入、加入1.5ml 20%KOH-1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀；甲醇溶液，充分摇匀；2 2、加入、加入5ml5ml苯，摇匀苯，摇匀 ；3 3、加入适量蒸馏水，沿管壁。、加入适量蒸馏水，沿管壁。注注意意：如如果果分分层层后后下下部部的的溶溶液液浑浑浊浊，可可以以剧剧烈烈摇摇动动，对对试试管管加加温温，溶溶液液很很快快分分层层，絮絮状状物物消消失失，溶溶液液变变得得清清澈透明。原因，可能是温度较低引起的。澈透明。原因，可能是温度较低引起
16、的。（4)4)、吸收光谱的观察、吸收光谱的观察叶叶绿绿素素与与类类胡胡萝萝卜卜素素都都具具有有光光学学活活性性，表表现现出出一一定定的的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定太太阳阳光光不不是是单单一一的的光光，当当一一束束阳阳光光通通过过三三棱棱镜镜后后，就就象象雨雨后后的的彩彩虹虹那那样样，可可分分为为红红、橙橙、黄黄、绿绿、青青、蓝蓝、紫紫七七种种颜颜色色，形形成成连连续续的的可可见见光光谱谱。如如果果在在阳阳光光与与三三棱棱镜镜之之间间插插入入一一支支盛盛有有叶叶绿绿素素的的试试管管，那那么么，在在光光谱谱中中的的红红光光与与蓝蓝紫
17、紫光光的的部部位位就就会会出出现现很很深深的的黑黑带带，表表明明这这些些光光线线已已被被叶叶绿绿素素强强烈烈吸吸收收；而而绿绿光光部部位位没没有有黑黑带带，也也就就是是未未被被吸吸收收。因因此此，叶叶绿绿素素呈呈现现绿绿色色。胡胡萝萝卜卜素素与与叶叶黄黄素素主主要要吸吸收收蓝蓝紫紫光，基本上不吸收黄光，从而呈现黄色。光，基本上不吸收黄光，从而呈现黄色。(5)、H+和和Cu2+对叶绿素分子中对叶绿素分子中 Mg2+的取代作用的取代作用H+Cu2+叶叶绿绿素素中中的的可可MgMg2+2+被被H H+所所取取代代而而成成褐褐色色的的去去镁镁叶叶绿绿素素，后后者者遇遇铜铜则则成成为为绿绿色色的的铜铜代
18、代叶叶绿绿素素，铜铜代代叶叶绿绿素素很很稳稳定定，在在光光下下不不易易破破坏坏，故故常常用用此此法法制制作作绿绿色色多多汁汁植植物物的的浸渍标本。浸渍标本。1 1小试管小试管步骤：步骤：加乙醇色素提取液加乙醇色素提取液2ml2ml稀释稀释3 3倍倍取出取出1/31/3放到放到2 2（CK1CK1）加加5 5盐酸盐酸1 1滴滴摇均匀摇均匀取出取出1/21/2放到放到3 3（CK2CK2）加入醋酸铜粉末少许加入醋酸铜粉末少许不断摇动，文火加热（严禁放到火上烧）不断摇动，文火加热（严禁放到火上烧）3 3支试管进行比较，记录颜色变化支试管进行比较，记录颜色变化 加加热热时时试试管管不不能能靠靠近近火火焰焰，温温度度过高将破坏叶绿素。过高将破坏叶绿素。加加热热时时试试管管不不能能靠靠近近火火焰焰，温温度度过过高高将破坏叶绿素。将破坏叶绿素。三、三、结果记录：填写记载表结果记录：填写记载表 洗刷干净，器皿摆放整齐洗刷干净，器皿摆放整齐研钵壁上易吸附色素，用什么洗刷？研钵壁上易吸附色素，用什么洗刷？节约使用试剂节约使用试剂