选修基因工程简指南.pptx

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1、考纲要求1、基因工程的诞生 2、基因工程的原理及技术 3、基因工程的应用 4、蛋白质工程 第1页/共63页基因的结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。1、原核细胞的基因结构第2页/共63页不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。:能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质 编码区非编码区原核细胞的 基因结构有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，

2、最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。启动子1、原核细胞的基因结构第3页/共63页2、真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子 外显子 外显子：编码区中能编码蛋白质的序列内含子：编码区中不能编码蛋白质的序列启动子终止子编码区上游 编码区下游 第4页/共63页真核细胞的 基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子2、真核细胞的基因结构第5页/共63页原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间

3、隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码第7页/共63页 区分：启动子与起始密码 启启启启 动动动动 子子子子 起起起起 始始始始 密密密密 码码码码 位位位位 置置置置位位位位于于于于DNADNADNADNA上上上上基基基基因因因因的的的的非非非非编编编编码码码码区区区区，在在在在编编编编码码码码区区区区上游段（左侧）上游段（左侧）上游段（左侧）上游段（左侧）位位位位于于于于mRNAmRNAmRNAmRNA上上上上的的的的开开开开始始始始即即即即单

4、单单单链链链链信信信信使使使使RNA RNA RNA RNA（转录产物）（转录产物）（转录产物）（转录产物）功功功功 能能能能转转转转录录录录时时时时与与与与RNARNARNARNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶结结结结合合合合，对对对对转转转转录录录录mRNAmRNAmRNAmRNA起调控作用。起调控作用。起调控作用。起调控作用。是是是是翻翻翻翻译译译译的的的的开开开开始始始始，是是是是肽肽肽肽链链链链延延延延伸伸伸伸的的的的第第第第一一一一个个个个氨基酸的位点。氨基酸的位点。氨基酸的位点。氨基酸的位点。第8页/共63页 区分：区分：终止子与终止密码终止子与终止密码 终终 止止 子子 终终止密码止

5、密码 位位 置置位于位于DNA上基因的非编上基因的非编码区，在编码区下游段码区，在编码区下游段（右侧）（右侧）位于位于mRNA上，上，如如UAA UAG UGA 功功 能能阻碍阻碍RNA聚合酶的移动，聚合酶的移动，从从DNA模板上脱落。模板上脱落。表示一条肽链表示一条肽链翻译的完成翻译的完成 11第9页/共63页基因工程的概念基因工程的概念 定义：定义：又称为重组又称为重组又称为重组又称为重组DNADNADNADNA技术，指按照人们的愿望，进技术，指按照人们的愿望，进技术，指按照人们的愿望，进技术，指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外行严格的设计，并通过体外行严格的设计，并通过体外行严

6、格的设计，并通过体外DNADNADNADNA重组和转基因等重组和转基因等重组和转基因等重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出更技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出更技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出更技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。符合人们需要的新的生物类型和生物产品。符合人们需要的新的生物类型和生物产品。符合人们需要的新的生物类型和生物产品。目的目的:是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并能稳定遗

7、传。新性状，并能稳定遗传。新性状，并能稳定遗传。新性状，并能稳定遗传。第10页/共63页基因工程的概念基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物剪切 拼接 导入 检测实质基因重组第11页/共63页1.1 基因操作的工具基因的大小以纳米计算，对其操作，需要非常精细的工具。进行基因操作最少需要以下三种工具：分子剪刀限制性核酸内切酶分子针线DNA连接酶分子运输车运载体第13页/共63页1 1、限制性核酸内切酶（限制酶）（1）作用部位：磷酸二酯键（2）特点：专一性，即识别特

8、定核苷酸序列，切割特定位点。（3 3）举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别）举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开。之间切开。第14页/共63页（4 4）来源：主要从原核生物中分离）来源：主要从原核生物中分离 原因：限制酶是在生物体原因：限制酶是在生物体(主要是微生物主要是微生物)内的一种酶，能将外来的内的一种酶，能将外来的DNADNA切断，对切断，对自己自己DNADNA无害，保护细胞原有遗传信息，由于这种切割作用是在无害，保护细胞原有遗传信息，由于这种切割作用是在DNADNA分子内部进行的，分子内部进行的，故名限制性内切酶。故名限制性

9、内切酶。（真核生物一般有其他保护措施）（真核生物一般有其他保护措施）注意：限制酶是指注意：限制酶是指一类酶一类酶，而不是一种酶。，而不是一种酶。第15页/共63页（5）作用结果：形成DNA片段末端平末端平末端平末端平末端：平切（相同部位）：平切（相同部位）：平切（相同部位）：平切（相同部位）黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端：错位切（不同部位）：错位切（不同部位）：错位切（不同部位）：错位切（不同部位）第16页/共63页第17页/共63页DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制酶切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。121212第18页/共63页什么叫黏

10、性末端？被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口，带有几个两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，它们之间正好，它们之间正好互互补配对补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。第19页/共63页讨论1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。讨论2.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就可以合成重组的DNA分子。第20页/共63页、基因的针线DNA连接酶（2）连接的部位：DNA双链片段间的磷酸二酯键 （注意：不是氢键）。（1

11、）连接酶的作用：将两个双链DNA片段连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。第21页/共63页（3）常用种类：E.coliDNAE.coliDNA连接酶连接酶来源：大肠杆菌作用：连接黏性末端T4DNA连接酶来源：T4噬菌体作用：连接黏性末端、平末端第22页/共63页（4）与DNA聚合酶的比较DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶化学本质化学本质作用部位作用部位模板模板蛋白质蛋白质磷酸二酯键（单个脱氧核苷酸+片段）磷酸二酯键（DNA双链片段+DNA双链片段）需要（DNA一条链）不需要第23页/共63页3、基因的运输工具运载体（3 3 3 3）种类：）种类：）种类：）种类：质粒质粒质粒质

12、粒、入噬菌体衍生物和动植物病毒。、入噬菌体衍生物和动植物病毒。、入噬菌体衍生物和动植物病毒。、入噬菌体衍生物和动植物病毒。（1）作用：将外源基因送入受体细胞。（2）条件：能在宿主细胞内复制并稳定地保存。具有一个至多个限制酶切点，使外源基因插入其中。具有某些标记基因，以便进行筛选。如抗菌素抗性基因、产物具有颜色反应如抗菌素抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。的基因等。安全，对受体细胞无害，不影响其正常活动。大小适合，便于提取和体外操作要根据受体细胞的类型选择合适运载体第24页/共63页运载体最常用的运载体-质粒第25页/共63页1.2 基因工程的基本操作程序第26页/共63页一、目的基因的获取1

13、、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因2、获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）PCR技术扩增（3）人工合成11第27页/共63页(1)从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，导入到片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库的不同基因，称为基因文库.基因文库 基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）基因文库第28页/共63页 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术 条件：_、_、_、_.原理：_方式：以_方式扩增，即_（n为

14、扩增循环的次数）结果：选修1聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内大量扩增(2)利用PCR技术扩增目的基因12第29页/共63页过程：a、DNA变性（90-95）：目的基因DNA受热变性，_断裂，形成_b、复性（55-60）：系统温度降低，引物与DNA模 板结合，形成局部_。c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的 5端3端延伸，合成与模板互补的_。以上步骤循环进行 氢键单链DNA双链DNA链第30页/共63页1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。2.用_切断目 的基因，使其

15、产生_ _。二、基因表达载体的构建3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同 核心第31页/共63页质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）核心同一种二、基因表达载体的构建4.过程:第32页/共63页5.基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们有什么作用？核心二、基因表达载体的构建第33页/共63页复制原点：DNA的复制有特定的起始位点。启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别

16、和结合的部位，启动转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的：位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，能终止片断，能终止mRNAmRNA的转录。的转录。标记基因：作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来.第34页/共63页Bam H切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割载体DNA用Bam H切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接第35页/共63页不同限制酶切位点的连接Eco R切割位点Bg l切割位点+EcoR+Bg l双酶切Eco R+Bg l双酶切T4 DNA连接酶15

17、C重组体第36页/共63页三、将目的基因导入受体细胞转化 方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法感受态细胞目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程受体细胞稳定表达第37页/共63页1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌：（2）原理及适用范围：三、将目的基因导入受体细胞第38页/共63页2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（2）程序：载体提纯）程序：载体提纯-取卵取卵-显微显微注射注射-早期胚胎培养早期胚胎培养-胚胎移植胚胎移植-发

18、发育育三、将目的基因导入受体细胞3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1 1）选用微生物作为受体细胞的原因）选用微生物作为受体细胞的原因（2 2）方法：）方法：CaCa2+2+处理处理感受态感受态11第39页/共63页四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检测鉴定检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质个体水平：抗虫、抗病鉴定、活性鉴定等方法DNA分子杂交(DNA-DNA)方法分子杂交（DNA-RNA）方法抗原-抗体杂交（蛋白质杂交）第40页/共63页DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的D

19、NA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。第41页/共63页1）以下说法正确的是 A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来C巩固练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNAD第42页/共63页3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连

20、接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A A4）有关基因工程的叙述正确的是 （）A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D D第43页/共63页5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达C C6)6)下列关于基因工程应用的叙述，正确的是下列关于基因工程应用的叙述，正确的是

21、A.A.基因治疗就是把缺陷基因诱变成正常基因基因治疗就是把缺陷基因诱变成正常基因 B.B.基因诊断的基本原理是基因诊断的基本原理是DNADNA分子杂交分子杂交 C.C.一种基因探针能检测水体中的各种病毒一种基因探针能检测水体中的各种病毒 D.D.原核基因不能用来进行真核生物的遗传改良原核基因不能用来进行真核生物的遗传改良B B第44页/共63页(2006年江苏卷15题)我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是A基因非编码区对于抗虫基因在棉花细胞中的表达不可缺少B重组DNA分子中增加一个碱基对，不一定导致毒蛋白的毒性丧失C抗

22、虫棉的抗虫基因可通过花粉传递到近缘作物，从而造成基因污染D转基因棉花是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性来确定的D第45页/共63页（2006年全国卷5题）采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是，人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是A人体细胞中凝血因子基因编码区的碱基对数目，等于凝血因子氨基酸数目的3倍B可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组DNA分子导入羊的受精卵C在该转基因样中，人凝血因子基因存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中D人凝血因子基因开始转录后，DNA连接酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNAB第46页/共63

23、页（2006年四川卷4题）基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是A.常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒B.DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶C.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒D.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达B第47页/共63页（20062006年江苏卷年江苏卷4141题）基因工程又叫基因拼接技术。题）基因工程又叫基因拼接技术。（1 1）在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：以目的基因转录的）在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：以目的基因转录的 为模板，为模板，成互补的单链成互补的单链DNA

24、DNA，然后在酶的作用下合成，然后在酶的作用下合成 。（2 2）常用的受体细胞有细菌、真菌、）常用的受体细胞有细菌、真菌、。若将真核基因在原核细胞中表达，。若将真核基因在原核细胞中表达，对该目的基因的基本要求是对该目的基因的基本要求是 。（3 3）假设以大肠杆菌质粒作为运载体）假设以大肠杆菌质粒作为运载体,并以同一种限制性内切酶切割运载体与目的基因并以同一种限制性内切酶切割运载体与目的基因,将切割后的运载体与目的基因片段混合将切割后的运载体与目的基因片段混合,并加入并加入DNADNA连接酶连接酶,连接产物至少有连接产物至少有_种环状种环状DNADNA分子，它们分别是分子，它们分别是 。信使RN

25、A反转录双链DNA动植物细胞除去内含子3运载体自连的、目的基因片段自连的、运载体与目的基因片段相连的环状DNA分子第48页/共63页1.3 基因工程的应用基因工程的应用是基因工程基本操作程序的必然结果）第49页/共63页一、植物基因工程一、植物基因工程 植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。1、抗虫转基因植物方法：从某些生物中分离出具有杀虫活性的基因，将其导入作物中，使其具有抗虫性。目的基因：Bt毒蛋白基因蛋白酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因植物凝集素基因等第50页/共63页2、抗病转基因植物 通过转基因技术，培育出具有抗病能力（抗病毒、细菌、

26、真菌等病原体）的栽培作物。常用的基因：病毒外壳蛋白基因（CP基因）病毒复制酶基因几丁质酶基因抗毒素合成基因第51页/共63页3、抗逆转基因作物抗逆：抵抗某种不利环境条件（如干旱、低温、盐碱、涝害等）常用基因：调节细胞渗透压的基因抗冻蛋白基因抗除草剂基因4、利用转基因改良植物的品质常用基因：某些必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因：将其导入植物中，或改变这些氨基酸合成途径中某种酶的活性延熟基因第52页/共63页三、动物基因工程1、用于提高动物生长速度如：生长激素基因导入各种饲养动物2、用于改善畜产品的品质如：肠乳糖酶基因导入奶牛第53页/共63页3、用转基因动物生产药物用基因工程技术实现动物乳腺生物

27、反应器的操作过程：获取目的基因（例如血清蛋白基因）构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）显微注射导入哺乳动物受精卵中形成胚胎将胚胎送入母体动物发育成转基因动物（只有在产下的雌性动物个体中，转入的基因才能表达）第54页/共63页4、用转基因动物作器官移植的供体供体动物：存在的难题：解决方法：猪免疫排斥将供体基因组导入某种基因调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。第55页/共63页三、基因工程药品工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。我国已生产的产品：白细胞介素-2(糖蛋白

28、)干扰素(糖蛋白)乙肝疫苗(乙肝病毒表面抗原)等第56页/共63页四、基因治疗四、基因治疗基因治疗：将正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发生功能，从而达到治疗疾病的目的。意义：治疗遗传病的最有效手段。1.体外基因治疗：1.体内基因治疗：从病人体内获得某种细胞培养在体外完成基因转移筛选成功转移的细胞扩增培养重新输入患者体内。直接向人体组织细胞中转移基因。第57页/共63页用于基因治疗的基因种类用于基因治疗的基因种类A.从健康人体上分离得到的功能正常的基因，用以取代病变基因，或依靠其表达产物。从健康人体上分离得到的功能正常的基因，用以取代病变基因，或依靠其表达产物。B.反义基因。即通过产生的

29、反义基因。即通过产生的mRNA分子，与病变基因产生的分子，与病变基因产生的mRNA 进行互补，来阻进行互补，来阻断蛋白质合成。断蛋白质合成。C.编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因自杀基因。自杀基因。第58页/共63页1.4 蛋白质工程第59页/共63页基因工程与蛋白质工程的比较：基因工程与蛋白质工程的比较：基因工程：原则上只能生产自然界基因工程：原则上只能生产自然界已存在已存在的蛋白质。的蛋白质。蛋白质工程：可制造自然界蛋白质工程：可制造自然界原本没有原本没有的新蛋白质。是基因工程的延伸。的新蛋白质。是基因工程的延伸。n n蛋白质工程的概念：以蛋白质分子的结构规律

30、及其与生物功能的关以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。以满足人类的生产和生活的需求。第60页/共63页预期功能推测推测二、蛋白质工程的基本原理基因mRNA转录转录氨基酸序列(多肽链)翻译翻译蛋白质三维结构折叠折叠生理功能体现体现分子分子设计设计推测推测推测推测mRNA转录转录氨基酸序列(多肽链)翻译翻译蛋白质三维结构折叠折叠生理功能体现体现1.原理：中心法则的逆推2.蛋白质工程的流程蛋白质工程的流程中心法则第61页/共63页三、蛋白质工程的进展和前景 蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。但是，由于对大多数蛋白质的高级结构了解不够，因此目前成功例子不多。第62页/共63页感谢您的观看！第63页/共63页