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1、选修选修3 生态工程生态工程生物技术的安全性生物技术的安全性和伦理问题和伦理问题胚胎工程胚胎工程细胞工程细胞工程基因工程基因工程现代生物科技现代生物科技专题专题第1页/共30页第2页/共30页专题1.基因工程 基因工程的概念基因工程的概念1.1 基因工程的基本工具基因工程的基本工具1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 基因工程的发展史基因工程的发展史1.3 基因工程的应用基因工程的应用1.4 蛋白质工程的崛起蛋白质工程的崛起第3页/共30页基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们
2、需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。第4页/共30页基因工程基因工程名称名称基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术实质实质:基因重组基因重组操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象基因基因操作水平操作水平DNADNA分子水平分子水平基本过程基本过程“剪切剪切”“”“拼接拼接”“”“导入导入”“”“表达表达”结果结果人类需要的基因产物人类需要的基因产物基因工程的概念基因工程的概念这种技术是在生物体外，通过对这种技术是在生物体外，通过对DNADNA分子进行人工分子进行人工“剪切剪切”和和“
3、拼接拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。类所需要的基因产物。第5页/共30页 为什么能把一种生物的基因为什么能把一种生物的基因“嫁接嫁接”到另一种生物上并成功表达？到另一种生物上并成功表达？即：（即：（1）不同生物）不同生物DNA分子的基分子的基本结构是相同的，都遵循碱基互补本结构是相同的，都遵循碱基互补配对原则。配对原则。（2）生物界共用一套遗传密码。）生物界共用一套遗传密码。第6页/共30页基因工程
4、培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体与运载体与运载体DNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入棉花细胞棉花细胞(含抗虫基因含抗虫基因)棉花植株棉花植株(有抗虫特性有抗虫特性)上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？第7页/共30页基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内细胞内提取出来提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与运载体与运
5、载体DNA连接连接关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因导入受体导入受体(棉花棉花)细胞细胞第8页/共30页解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一的工具：关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：关键步骤三的工具：基因的基因的剪刀剪刀限制酶限制酶基因的基因的针线针线DNA连接酶连接酶基因的基因的运载工具运载工具运载体运载体第9页/共30页一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”分分 布：布：主要从原核生物中分离纯化得到主要从原核生物中分离纯化得到作用特点：作用特点：特异性，即识别特异性，即识别双链双链DNA分子的分子的
6、特定核苷酸序列，切割特定切点特定核苷酸序列，切割特定切点切切 点：点：每一条链中每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的特定部位的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键磷酸二酯键种种 类：类：约约4000种种举举 例：例：EcoRI限制酶能识别限制酶能识别GAATTC序列，序列，并在并在G和和A之间切开之间切开结结 果：果：形成两种末端形成两种末端黏性末端黏性末端平末端平末端第10页/共30页限制酶所识别的序列有什么特点 限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。第11页/共30页限制性内切酶限制限制酶酶第12页/共30页1.
7、什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，开时，被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切两条单链的切口，带有几个口，带有几个伸出的核苷酸，伸出的核苷酸，他们之间正他们之间正好好互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端。黏性末端。第13页/共30页DNADNA被限制酶切断后有两个反向互补的被限制酶切断后有两个反向互补的“黏黏性末端性末端”。被同一种限制切断的几个。被同一种限制切断的几个DNADNA具有相具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。同的黏性末端，能够通过互补进行配对。第14页/共30页2.什么叫平末端什
8、么叫平末端？当限制酶从识别序列的中心轴线处切当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的开时，切开的DNADNA两条单链的切口，是平两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫整的，这样的切口叫平末端平末端。第15页/共30页限制酶的识别序列：限制酶的识别序列：中轴线两侧的双链中轴线两侧的双链DNA上的碱基是上的碱基是反反向对称、重复排列向对称、重复排列的的第16页/共30页要想获得目的基因必须要用限制酶切几个切要想获得目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性口？可产生几个黏性(平平)末端？末端？要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性(平平)末端。末端。要把要把目的基因插入运载
9、体的前提是什么目的基因插入运载体的前提是什么必须用必须用同一种限制酶来切割目的基因和运载体。同一种限制酶来切割目的基因和运载体。思考思考?第17页/共30页CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAAAATTCCGTAG 练习使用练习使用EcoRI 剪切目的基因剪切目的基因CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAAAATTCCGTAG 目的基因目的基因黏性末端黏性末端第18页/共30页3.限制酶在原核生物中的作用 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一
10、套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。第19页/共30页二、DNA连接酶“分子缝合针”1.1.连接酶有两种：连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为EcoliEcoli连接酶。连接酶。另一种是从另一种是从T4T4噬菌体中分离
11、得到，称为噬菌体中分离得到，称为T T4 4连接酶连接酶。2.2.这两种连接酶催化反应基本相同，这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链都是连接双链DNADNA的缺口，的缺口，而不能连接单链而不能连接单链DNADNA。3.Ecoli3.Ecoli连接酶只能连接黏性末端；连接酶只能连接黏性末端；T T4 4连接酶既可连接酶既可“缝合缝合”黏性末端，又可黏性末端，又可“缝合缝合”平末端。平末端。第20页/共30页DNA连接酶“分子缝合针”DNA连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？第21页/共30页 可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，Ecoli DNAEcoli
12、DNA连接酶或连接酶或连接酶或连接酶或T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶即即即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键第22页/共30页T4 DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶第23页/共30页使用使用DNA连接酶制作重组连接酶制作重组DNA分子分子甲片段甲片段CTTCATG AATTCCCTAA GAAG
13、TACTTAA GGGATT 乙片段乙片段GGCATCTTAAAATTCCGTAG 重组重组DNA分子分子Recombinant DNAGGCATCTTAAAATTCCGTAG 第24页/共30页答：答：不是一回事。（在相邻核苷酸的不是一回事。（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与位碳原子上的羟基与5位碳原位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成）子上所连磷酸基团的羟基之间形成）（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端末端 的羟基上，形成磷酸二酯键；的羟基上，形成磷酸二酯键；而而DNA连接酶是在两个连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯
14、键。片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸链为模板，将单个核苷酸通过磷酸 二酯键形成一条与模板链互补的二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；链；而而DNA连接酶是将连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。双链上的两个缺口同时连接起来。因此因此DNA连接酶不需要模板。连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。第25页/共30页比较项目比较项目DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶相同点相同点作用实质相同，都是催化两个核苷酸之间作用实质相同，
15、都是催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键不不同同点点是否需要模板是否需要模板不需要不需要需要需要接接DNA链链双链双链单链单链作用过程作用过程在两个在两个DNA片片段间形成磷酸段间形成磷酸二酯键二酯键将单个核苷酸加到已存将单个核苷酸加到已存在的在的DNA单链片段上，单链片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键作用结果作用结果将已存在的将已存在的DNA片段连接片段连接合成新的合成新的DNA分子分子用途用途基因工程基因工程DNA复制复制第26页/共30页三、基因的载体“分子运输车”2.载体必须具备的条件：载体必须具备的条件：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；
16、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有某些标记基因，便于进行筛选；具有某些标记基因，便于进行筛选；（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）对受体细胞无害。对受体细胞无害。1.载体的作用：载体的作用：将外源基因转移到受体细胞中去。将外源基因转移到受体细胞中去。利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。3.常用的载体有：常用的载体有：质粒，质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等噬菌体的衍生物，动植物病毒等第27页/共30页质粒 质粒是基因工质粒是基因工程最常用的运载体，程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外中，是细菌染色体外能够自主复制的很小能够自主复制的很小的环状的环状DNA分子，分子，大小只有普通细菌拟大小只有普通细菌拟核核DNA的百分之一。的百分之一。要对天然质粒进行人工改造要对天然质粒进行人工改造第28页/共30页能复制并带着插能复制并带着插入的目的基因一入的目的基因一起复制起复制有切割位点有切割位点有标记基因的存有标记基因的存在，将来可用含在，将来可用含青霉素的培养基青霉素的培养基鉴别。鉴别。第29页/共30页感谢您的观看！第30页/共30页