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1、蛋白酶分离纯化技术2005/20062005/20062005/20062005/2006华南师范大学生命科学学院 第七节第七节第七节第七节 电泳分离电泳分离电泳分离电泳分离 带带带带电电电电粒粒粒粒子子子子在在在在电电电电场场场场中中中中向向向向着着着着与与与与其其其其本本本本身身身身所所所所带带带带电电电电荷荷荷荷相相相相反反反反的的的的电电电电极移动的过程称为电泳。极移动的过程称为电泳。极移动的过程称为电泳。极移动的过程称为电泳。电电电电泳泳泳泳方方方方法法法法各各各各式式式式各各各各样样样样，使使使使用用用用的的的的支支支支持持持持物物物物(体体体体)的的的的不不不不同同同同，可可可可
2、以以以以分为分为分为分为 纸电泳纸电泳纸电泳纸电泳 薄层电泳薄层电泳薄层电泳薄层电泳(硅胶硅胶硅胶硅胶GGGG薄层薄层薄层薄层)薄膜电泳薄膜电泳薄膜电泳薄膜电泳(醋酸纤微素薄膜醋酸纤微素薄膜醋酸纤微素薄膜醋酸纤微素薄膜)凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳 等电聚焦电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳一一一一 电泳的基本原理电泳的基本原理电泳的基本原理电泳的基本原理 不同的蛋白酶的带电性质（带电量和带何种电荷），大小不同的蛋白酶的带电性质（带电量和带何种电荷），大小不同的蛋白酶的带电性质（带电量和带何种电荷），大小不同的蛋白酶的带电性质（带电量和带何种电荷），大小和形状不同，在一定的电场下，它
3、们的移动方向和移动速和形状不同，在一定的电场下，它们的移动方向和移动速和形状不同，在一定的电场下，它们的移动方向和移动速和形状不同，在一定的电场下，它们的移动方向和移动速度也不同，从而得到分离。度也不同，从而得到分离。度也不同，从而得到分离。度也不同，从而得到分离。可分离不同的蛋白酶可分离不同的蛋白酶可分离不同的蛋白酶可分离不同的蛋白酶(制备性电泳制备性电泳制备性电泳制备性电泳)分析其蛋白性质如分子量和等电点等分析其蛋白性质如分子量和等电点等分析其蛋白性质如分子量和等电点等分析其蛋白性质如分子量和等电点等(分析性电泳分析性电泳分析性电泳分析性电泳)移动方向移动方向移动方向移动方向 颗粒在电场中
4、的移动方向，决定于它们所带电荷的种类颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所带电荷的种类颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所带电荷的种类颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所带电荷的种类带正电荷的颗粒向电场的负极移动带正电荷的颗粒向电场的负极移动带正电荷的颗粒向电场的负极移动带正电荷的颗粒向电场的负极移动带负电荷的颗粒则向电场的正极移动带负电荷的颗粒则向电场的正极移动带负电荷的颗粒则向电场的正极移动带负电荷的颗粒则向电场的正极移动净电荷为零的颗粒在电场中不移动净电荷为零的颗粒在电场中不移动净电荷为零的颗粒在电场中不移动净电荷为零的颗粒在电场中不移动 移动速度移动速度 在电场中，颗粒的泳在电场中，颗粒
5、的泳在电场中，颗粒的泳在电场中，颗粒的泳(移移移移)动速度通常用迁移率来表示。动速度通常用迁移率来表示。动速度通常用迁移率来表示。动速度通常用迁移率来表示。迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度在电场中的泳动速度主要决定于在电场中的泳动速度主要决定于在电场中的泳动速度主要决定于在电场中的泳动速度主要决定于 颗粒（蛋白酶）本身所带的颗粒（蛋白酶）本身所带的颗粒（蛋白酶）本身所带的颗粒（蛋白酶）本身所带的净电荷量净电荷量 净电荷量越多净电荷量越多,泳动速度越快泳
6、动速度越快泳动速度越快泳动速度越快 颗粒（蛋白酶）的颗粒（蛋白酶）的颗粒（蛋白酶）的颗粒（蛋白酶）的大小大小 分子量越小分子量越小,泳动速度越快泳动速度越快泳动速度越快泳动速度越快 颗粒（蛋白酶）的颗粒（蛋白酶）的颗粒（蛋白酶）的颗粒（蛋白酶）的形状形状 球型较快球型较快球型较快球型较快,泳动速度越快泳动速度越快泳动速度越快泳动速度越快 电场强度电场强度电场强度电场强度 越大越大越大越大,泳动速度越快泳动速度越快泳动速度越快泳动速度越快 溶液溶液溶液溶液pHpHpHpH值值值值溶溶溶溶液液液液pHpHpHpH值值值值决决决决定定定定了了了了溶溶溶溶液液液液中中中中蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶的的的
7、的带带带带电电电电的的的的性性性性质质质质如如如如带带带带何何何何种种种种电荷个带电的多少电荷个带电的多少电荷个带电的多少电荷个带电的多少 离子强度离子强度离子强度离子强度 溶溶溶溶液液液液的的的的离离离离子子子子强强强强度度度度越越越越高高高高，颗颗颗颗粒粒粒粒的的的的泳泳泳泳动动动动速速速速度度度度则则则则越越越越慢慢慢慢。反反反反之之之之则则则则越越越越快快快快。一一一一般般般般电电电电泳泳泳泳溶溶溶溶液的离子强度为液的离子强度为液的离子强度为液的离子强度为0.02-0.20.02-0.20.02-0.20.02-0.2 电渗电渗电渗电渗 在电场中，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗在
8、电场中，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗在电场中，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗在电场中，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 在在在在毛毛毛毛细细细细管管管管电电电电泳泳泳泳中中中中，毛毛毛毛细细细细管管管管是是是是由由由由石石石石英英英英为为为为材材材材料料料料，含含含含硅硅硅硅酸酸酸酸成成成成分分分分，带带带带负负负负电电电电荷荷荷荷，使使使使毛毛毛毛细细细细管管管管中中中中溶溶溶溶液液液液感感感感应应应应而而而而带带带带正正正正电电电电荷荷荷荷。水水水水分分分分子子子子便便便便向向向向负负负负极极极极移动，并带动溶液中的蛋白酶等颗粒一起向负极移动移动，并带动溶液中的蛋白酶等颗
9、粒一起向负极移动移动，并带动溶液中的蛋白酶等颗粒一起向负极移动移动，并带动溶液中的蛋白酶等颗粒一起向负极移动 若蛋白酶带负电，泳动速度则变慢若蛋白酶带负电，泳动速度则变慢若蛋白酶带负电，泳动速度则变慢若蛋白酶带负电，泳动速度则变慢 一般要选择电渗较少的固体支持物一般要选择电渗较少的固体支持物一般要选择电渗较少的固体支持物一般要选择电渗较少的固体支持物(不带电不带电不带电不带电)若带正电，泳动速度则加快若带正电，泳动速度则加快若带正电，泳动速度则加快若带正电，泳动速度则加快 若不带电，颗粒也会向负极移动若不带电，颗粒也会向负极移动若不带电，颗粒也会向负极移动若不带电，颗粒也会向负极移动二，电泳技
10、术的应用范围二，电泳技术的应用范围二，电泳技术的应用范围二，电泳技术的应用范围 酶的纯度鉴定（分析电泳）酶的纯度鉴定（分析电泳）酶的纯度鉴定（分析电泳）酶的纯度鉴定（分析电泳）SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、PAGEPAGEPAGEPAGE、IEFIEFIEFIEF（电泳纯）电泳纯）电泳纯）电泳纯）酶酶酶酶全酶和亚基分子量全酶和亚基分子量测定测定测定测定 SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、PAGEPAGEPAGEPAGE pIpIpIpI测定测定测定测定 IEF IEF IEF IEF 酶的分离纯化（制备电泳）酶的分离纯化（制备
11、电泳）酶的分离纯化（制备电泳）酶的分离纯化（制备电泳）三，主要采用的电泳技术三，主要采用的电泳技术三，主要采用的电泳技术三，主要采用的电泳技术(支持物支持物支持物支持物)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 同时具有电荷和分子筛的双重作用，故具很高的分辨率同时具有电荷和分子筛的双重作用，故具很高的分辨率同时具有电荷和分子筛的双重作用，故具很高的分辨率同时具有电荷和分子筛的双重作用，故具很高的分辨率 Native-PAGE-Native-PAGE-Native-PAGE-Native-PAGE-蛋白在天然状态下的电泳蛋白在天然状态下的电泳蛋白在天然状态下的电泳
12、蛋白在天然状态下的电泳 SDS-PAGE-SDS-PAGE-SDS-PAGE-SDS-PAGE-蛋白在蛋白在蛋白在蛋白在SDSSDS变性下的电泳变性下的电泳变性下的电泳变性下的电泳 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳(核酸电泳核酸电泳核酸电泳核酸电泳)琼脂糖凝胶为电泳的支持物琼脂糖凝胶为电泳的支持物琼脂糖凝胶为电泳的支持物琼脂糖凝胶为电泳的支持物.方便但分辨率低方便但分辨率低方便但分辨率低方便但分辨率低 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳 聚丙烯酰胺凝胶的形成 丙烯酰胺和甲叉双聚丙烯酰胺为聚合单体,在聚合催化剂的催化下,聚合为聚丙烯酰
13、胺凝胶聚合的催化剂过硫酸铵和四甲基乙二胺(TEMED)光和化学核黄素四 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺有毒，液体有毒，液体有毒，液体有毒，液体 无毒，固体无毒，固体无毒，固体无毒，固体.聚合聚合聚合聚合聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶催化剂催化剂催化剂催化剂聚合单体丙烯酰胺的浓度和凝胶孔径的关系均一胶和梯度胶均一胶和梯度胶 聚丙烯酰胺凝胶通常由浓缩胶和分离胶组成 浓缩胶:丙烯酰胺浓度均为4%,起蛋白上样和浓缩的作用 分离胶:起分离蛋白的作用,丙烯酰胺浓度可以是相同的(均一胶),也可
14、以是不同的(梯度胶)梯度胶电泳的特点梯度胶电泳的特点分离胶的丙烯酰胺浓度由上至下形成从低到高的连续梯度,一般是4%-20%分辨率高可连续上样电泳时间长可消除电荷对迁移率的影响浓度梯度凝胶的配制浓度梯度凝胶的配制浓度梯度凝胶的配制浓度梯度凝胶的配制需采用梯度混合器，配制时，浓溶液置于混合室，稀溶液置于贮存室碱性电泳系统碱性电泳系统碱性电泳系统碱性电泳系统用pH8.3的电泳缓冲液，电泳向正极进行.下槽接正极，上槽接负极，以溴酚蓝为指示染料最常用可用于分析绝大多数的蛋白酶，因为其pI4.0的蛋白均适用 PAGEPAGE的用途的用途的用途的用途分析蛋白酶的纯度分析蛋白酶的纯度分析蛋白酶的纯度分析蛋白酶
15、的纯度蛋白泳动与蛋白大小，电荷和形状大小，电荷和形状有关，凝胶兼有分子筛的功能电泳的分辨率很高，可以把不同的蛋白酶分开一条带表明纯度高（电泳纯）蛋白酶在电场中的泳动速度决定于：蛋白酶在电场中的泳动速度决定于：蛋白酶在电场中的泳动速度决定于：蛋白酶在电场中的泳动速度决定于：蛋白酶的蛋白酶的蛋白酶的蛋白酶的净电荷量净电荷量蛋白酶形状形状和和和和大小（全酶分子量）大小（全酶分子量）分析蛋白酶的分析蛋白酶的全酶分子量全酶分子量全酶分子量全酶分子量电场强度溶液pH值离子强度电渗全酶分子量的对数全酶分子量的对数(Log Log M Mr r)和泳动距离成反比和泳动距离成反比 PAGE的局限性如果蛋白和杂蛋
16、白的pI相差很大，也要注意有些杂蛋白容易被忽视，因为两者泳动方向不同蛋白和电泳缓冲液的pH相同，蛋白不会泳动如果蛋白酶不同的多聚态并存，纯度高但也可能呈2-3条带电泳和其它方法如HPLC（高压液相色谱）结合起来，判断蛋白酶的纯度会更可靠!五五 SDS-PAGESDS-PAGE 在十二烷基硫酸钠在十二烷基硫酸钠(SDS)SDS)存在的条件下所作存在的条件下所作的聚丙烯酰胺凝胶电泳的聚丙烯酰胺凝胶电泳,称为称为SDS-SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称胺凝胶电泳，简称SDS-PAGESDS-PAGE巯基乙醇使蛋自中的二硫键还原1g蛋白和1.4gSDS结合形成蛋白-SDS胶束。SDS带大量的负
17、电荷SDS破坏蛋白质的非共价键 SDS-PAGESDS-PAGE的原理的原理的原理的原理各种蛋白-SDS胶束均带负电,且电荷量相近,电泳迁泳率只取决于胶束(亚基M Mr r)大小使含有亚基的蛋白质解离为各个亚基蛋白蛋白蛋白蛋白-SDSSDSSDSSDS胶束长轴的长度和蛋白胶束长轴的长度和蛋白胶束长轴的长度和蛋白胶束长轴的长度和蛋白亚基亚基M Mr r成正比成正比成正比成正比蛋白蛋白蛋白蛋白-SDSSDSSDSSDS胶束在水溶液中都成椭圆形，其短轴长胶束在水溶液中都成椭圆形，其短轴长胶束在水溶液中都成椭圆形，其短轴长胶束在水溶液中都成椭圆形，其短轴长度都为度都为度都为度都为18181818A A
18、 A A左右左右左右左右 SDSSDSSDSSDS与蛋白结合，并引起蛋自构象的变化与蛋白结合，并引起蛋自构象的变化与蛋白结合，并引起蛋自构象的变化与蛋白结合，并引起蛋自构象的变化测定蛋白亚基Mr研究蛋白纯度可结合PAGE、HPLC、IEF等SDS-PAGE的主要用途研究蛋亚基组成分辨率高(如果是梯度胶)方便易行是蛋白组学研究的核心技术SDSPAGE的优点精确度高(测定误差不超过10%)SDSPAGE中蛋白亚基Mr与电泳迁移率的关系SDS负电荷量远高于蛋白的电荷量，不同蛋白之间的蛋白-SDS胶束的电荷是近似的蛋白-SDS胶束均为椭圆形,蛋白之间的胶束的分的分子形状是子形状是近似的 蛋白亚基蛋白亚
19、基M Mr r的对数电泳迁移率成反比的对数电泳迁移率成反比 Log Log MrMr-电泳迁移率电泳迁移率蛋白-SDS胶束中蛋白/SDS比例并非都是 1:1.4同一蛋白能以不同的比例和SDS结合蛋白-SDS胶束甚至可以带负电荷SDSPAGE的缺点蛋白-SDS胶束中蛋白电荷量并非都可以忽视空间位阻妨碍蛋白和SDS的充分结合糖蛋白:糖蛋白的糖基会形成空间位阻,亚基Mr的对数与其电泳迁泳率不成线性关系蛋白受体:二硫键丰富,不容易彻底解离为亚基,所测亚基Mr会偏高胶束中蛋白/SDS的比例并非都是 1:1.4含辅酶的复合蛋白，多酶复合体等:其亚基Mr可能测不准碱性组蛋白和酸性铁氧还蛋白在SDS-PAGE
20、所测亚基Mr偏高组蛋白亚基Mr为21kD，但测定出为35kD 组蛋白的正电荷抵消了SDS部分负电荷胶束中蛋白电荷量不能忽视铁氧还蛋白的亚基Mr只有8kD，但Rf=0.8铁氧还蛋白不能和SDS充分结合强碱性的精蛋白在SDS-PAGE中会沉淀可能是精蛋白的正电荷和SDS的负电荷相差无几磷酸化前后的蛋白激酶能以不同的比例和能以不同的比例和SDSSDS结合结合其构象会发生改变，妨碍了蛋白和SDS的结合SDS-PAGE中所测亚基Mr会偏高同一蛋白能以不同的比例和SDS结合经磷酸化后，会使激酶的负电荷增加，同一钙调蛋白可以不同比例和同一钙调蛋白可以不同比例和SDSSDS结合结合不不不不同同同同Ca2+Ca
21、2+Ca2+Ca2+浓度下的钙调蛋白的电泳行为浓度下的钙调蛋白的电泳行为浓度下的钙调蛋白的电泳行为浓度下的钙调蛋白的电泳行为 SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE中的蛋白大小中的蛋白大小中的蛋白大小中的蛋白大小 无无无无Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+20202020kDkDkDkDCa2+Ca2+Ca2+Ca2+处于饱和状态处于饱和状态处于饱和状态处于饱和状态 12 12 12 12kDkDkDkDCa2+Ca2+Ca2+Ca2+处于亚饱和状态处于亚饱和状态处于亚饱和状态处于亚饱和状态 在在在在20-12kD20-12kD20-12kD20-12kD之间有多条带之
22、间有多条带之间有多条带之间有多条带 不同不同Ca2+Ca2+浓度下的钙调蛋白的疏水性质不同浓度下的钙调蛋白的疏水性质不同 疏水性质不同导致和疏水性质不同导致和SDS结合的比例不同 导致钙调蛋白有不同的大小导致钙调蛋白有不同的大小铁氧还蛋白和钙调蛋白是酸性蛋白，无论是否和SDS结合和结合程度如何，在碱性电泳系统的SDS-PAGE中均向负极泳动，只是迁移率不同而已蛋白蛋白蛋白蛋白-SDSSDSSDSSDS胶束可以带正电荷胶束可以带正电荷胶束可以带正电荷胶束可以带正电荷如果碱性蛋白和SDS结合率很低，达不到达不到1:1.4,1:1.4,它就可能向负极泳动。碱性蛋白能充分和SDS结合，但其所带正电荷比
23、SDS负电荷还要多，使蛋白-SDS胶束带正电，同样会向负极泳动 植物绿叶粗蛋白中含大量负极泳动的蛋白植物绿叶粗蛋白中含大量负极泳动的蛋白菜心绿叶粗蛋白经SDS-醋酸纤维素薄膜电泳,下方为正极,箭头处为蛋白样品点样的位置正极负极 植物绿叶粗蛋白中含有向负极泳动的蛋白植物绿叶粗蛋白中含有向负极泳动的蛋白菜心(A)和生菜(B)绿叶粗蛋白经SDS-醋酸纤维素薄膜电泳,下方为正极,箭头处为蛋白样品点样的位置正极负极AB 植物绿叶粗蛋白中向负极泳动的蛋白的氨植物绿叶粗蛋白中向负极泳动的蛋白的氨基酸组成基酸组成Table Table Table Table Amino Amino Amino Amino a
24、cid acid acid acid contents contents contents contents of of of of cathode cathode cathode cathode buffer buffer buffer buffer after after after after crude crude crude crude protein protein protein protein from from from from B.B.B.B.campestriscampestriscampestriscampestris sspsspsspssp.chinensisch
25、inensischinensischinensis var.var.var.var.utillisutillisutillisutillis leaves was subjected to SDS-PAGEleaves was subjected to SDS-PAGEleaves was subjected to SDS-PAGEleaves was subjected to SDS-PAGEAmino acid Content(%)Amino acid Content(%)Amino acid Content(%)Amino acid Content(%)Amino acid Conten
26、t(%)Amino acid Content(%)Amino acid Content(%)Amino acid Content(%)Asp 2.03 Asp 2.03 Asp 2.03 Asp 2.03 ThrThrThrThr 1.32 1.32 1.32 1.32 Ser 4.11 Ser 4.11 Ser 4.11 Ser 4.11 GluGluGluGlu 3.02 3.02 3.02 3.02GlyGlyGlyGly 4.56 Ala 2.09 4.56 Ala 2.09 4.56 Ala 2.09 4.56 Ala 2.09CysCysCysCys -Val 5.19 -Val
27、5.19 -Val 5.19 -Val 5.19Met -Met -Met -Met -IIeIIeIIeIIe 1.13 1.13 1.13 1.13LeuLeuLeuLeu 1.97 1.97 1.97 1.97 TyrTyrTyrTyr 2.16 2.16 2.16 2.16PhePhePhePhe 57.05 57.05 57.05 57.05 LysLysLysLys 10.15 10.15 10.15 10.15His 1.01 His 1.01 His 1.01 His 1.01 ArgArgArgArg 4.21 4.21 4.21 4.21Pro -Pro -Pro -Pro
28、 -TrpTrpTrpTrp -见:梁秀文等.植物绿叶粗蛋白在SDS-PAGE中向负极泳动的富含苯丙氨酸的碱性蛋白的测定.热带亚热带植物学报,2006,14（2）：126-129 植物绿叶植物绿叶乙醇酸氧化酶乙醇酸氧化酶含有含有向负极泳动的向负极泳动的蛋白蛋白Fig.SDS-denatured glycolate oxidase from B.B.B.B.campestriscampestriscampestriscampestris sspsspsspssp.chinensischinensischinensischinensis var.var.var.var.utillisutillis
29、utillisutillis leavesleavesleavesleaves was subjected to SDS-PAGE(A),CE(B)and acetate cellulose membrane electrophoresis(C).The polarity was shown and the arrow indicates the original of protein sample 植物绿叶植物绿叶乙醇酸氧化酶乙醇酸氧化酶中向负极泳动的蛋中向负极泳动的蛋白的氨基酸组成白的氨基酸组成TableTableTableTable Amino Amino Amino Amino aci
30、d acid acid acid contents contents contents contents of of of of cathode cathode cathode cathode buffer buffer buffer buffer after after after after partially partially partially partially purifiedpurifiedpurifiedpurified glycolate oxidase from from from from B.B.B.B.campestriscampestriscampestrisca
31、mpestris sspsspsspssp.chinensischinensischinensischinensis var.var.var.var.utillisutillisutillisutillis leaves leaves leaves leaves was subjected to SDS-PAGEwas subjected to SDS-PAGEwas subjected to SDS-PAGEwas subjected to SDS-PAGEAmino acid Content(%)Amino acid Content(%)Amino acid Content(%)Amino
32、 acid Content(%)Amino acid Content(%)Amino acid Content(%)Amino acid Content(%)Amino acid Content(%)Asp 3.14 3.08 4.19 Asp 3.14 3.08 4.19 Asp 3.14 3.08 4.19 Asp 3.14 3.08 4.19 ThrThrThrThr 1.48 1.64 2.15 1.48 1.64 2.15 1.48 1.64 2.15 1.48 1.64 2.15Ser 4.11 5.38 4.87 Ser 4.11 5.38 4.87 Ser 4.11 5.38
33、4.87 Ser 4.11 5.38 4.87 GluGluGluGlu 5.54 2.82 4.31 5.54 2.82 4.31 5.54 2.82 4.31 5.54 2.82 4.31GlyGlyGlyGly 5.54 4.27 4.25 Ala 1.98 1.77 1.25 5.54 4.27 4.25 Ala 1.98 1.77 1.25 5.54 4.27 4.25 Ala 1.98 1.77 1.25 5.54 4.27 4.25 Ala 1.98 1.77 1.25CysCysCysCys -Val 7.49 1.38 1.76 -Val 7.49 1.38 1.76 -Va
34、l 7.49 1.38 1.76 -Val 7.49 1.38 1.76 Met -Met -Met -Met -IIeIIeIIeIIe 2.32 1.64 0.92 2.32 1.64 0.92 2.32 1.64 0.92 2.32 1.64 0.92 LeuLeuLeuLeu 2.89 2.89 1.66 2.89 2.89 1.66 2.89 2.89 1.66 2.89 2.89 1.66 TyrTyrTyrTyr 1.48 1.90 2.10 1.48 1.90 2.10 1.48 1.90 2.10 1.48 1.90 2.10PhePhePhePhe 60.00 65.62
35、62.30 60.00 65.62 62.30 60.00 65.62 62.30 60.00 65.62 62.30 LysLysLysLys 10.15 6.17 3.06 10.15 6.17 3.06 10.15 6.17 3.06 10.15 6.17 3.06His -1.53 His -1.53 His -1.53 His -1.53 ArgArgArgArg 2.53 1.44 3.00 2.53 1.44 3.00 2.53 1.44 3.00 2.53 1.44 3.00见:曾秋莲等.植物中在SDS-PAGE中向负极泳动的富含苯丙氨酸的蛋白的发现.中国生物化学与分子生物学报
36、,2006,22(1):86-90 发现蛋白发现蛋白-SDSSDS胶束向负极泳动的意义胶束向负极泳动的意义 蛋白性质和蛋白组学研究有缺陷蛋白性质和蛋白组学研究有缺陷负极泳动的蛋白容易被忽视负极泳动的蛋白容易被忽视解释有些蛋白的电荷不均一性解释有些蛋白的电荷不均一性很多蛋白经一些方法证实是纯的，如SDS-PAGE后只有单带，但IEF却含多个pI。目前对其中的原因众说纷纭，尚无公认的解释，有人认为是空间构象不同所引起，但未有确切的证据。猪生长激素经SDS-PAGE后只有28kD带，IEF却有6.0-7.2等五个pI。猪生长激素可能含两种不同的亚基，其中28kD是个普通蛋白；而另一个亚基则在SDS-
37、PAGE中是向负极泳动，因而被忽视 蛋白蛋白-SDSSDS胶束向负极泳动的机理胶束向负极泳动的机理蛋白蛋白/SDSSDS胶束带正电胶束带正电蛋白是个碱性蛋白蛋白是个碱性蛋白碱性蛋白的正电荷比碱性蛋白的正电荷比SDSSDS的负电荷还要多的负电荷还要多碱性蛋白碱性蛋白/SDSSDS的结合比例远低于的结合比例远低于1:1.41:1.4六六六六 等等等等电电聚焦聚焦聚焦聚焦电电泳泳泳泳等电聚焦电泳简称为等电聚焦。是在等电聚焦电泳简称为等电聚焦。是在等电聚焦电泳简称为等电聚焦。是在等电聚焦电泳简称为等电聚焦。是在1966196619661966年成功地合成载年成功地合成载年成功地合成载年成功地合成载体两
38、性电解质以后才发展起来的电泳技术体两性电解质以后才发展起来的电泳技术体两性电解质以后才发展起来的电泳技术体两性电解质以后才发展起来的电泳技术在电泳系统中加入两性电解质载体，通电后，载体两性电解质即在电场中形成一个由负极到正极连续变化的pH梯度当蛋白质,酶或多肽进入这个pH梯度时，不同的蛋白质会不断地泳动,直至到达(聚焦)与其pI相当的pH位置上用于分离具有不同pI的蛋白和测定蛋白的pI 等电聚焦电泳的特点等电聚焦电泳的特点等电聚焦电泳的特点等电聚焦电泳的特点浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应(或称聚焦效应或称聚焦效应或称聚焦效应或称聚焦效应)分离仅仅决定于蛋白质的pI。电泳中区带越来越窄，克服了
39、其他电泳中存在的扩散作用。一旦蛋白质到达它的等电点位置，它就没有净电荷，蛋白质只能在它的等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的带与与与与样品加样位置无关不管样品加在什么部位，都可以聚焦到与其等电点相当的pH的位置很稀的样品都可分离，而且重现性好 分辨率高分辨率高分辨率高分辨率高可将pI仅相差0.01-0.02pH单位的蛋白质分开 等电聚焦电泳的载体等电聚焦电泳的载体等电聚焦电泳的载体等电聚焦电泳的载体-两性电解质两性电解质两性电解质两性电解质 用用用用IEFIEFIEFIEF离蛋白质，必须要有一个稳定的和线性的离蛋白质，必须要有一个稳定的和线性的离蛋白质，必须要有一个稳定的和线性的离蛋白质，必须要有
40、一个稳定的和线性的pHpHpHpH梯度梯度梯度梯度早期发现谷氨酸，组氨酸或赖氨酸能产生大约1pH的梯度但pH范围太窄，且缓冲能力不够蛋白质分子本身也是两性电解质，在电泳时，它会影响梯度的pH 两性电解质必须具备的条件两性电解质必须具备的条件两性电解质必须具备的条件两性电解质必须具备的条件 在等电点状态下有足够的缓冲能力在等电点状态下有足够的缓冲能力在等电点状态下有足够的缓冲能力在等电点状态下有足够的缓冲能力 在等电点状态下有足够的导电能力，而且各个等电点不同的两性电解质有相同的导电系数，使整个体系中电导均匀两性电解质的紫外吸收低,以便IEF后的检测以便在IEF后两性电解质不干扰蛋白的检测分子量
41、要小,以便在IEF后易于分开蛋白和两性电解质化学组分应与待分离的样品组分不同化学组分应与待分离的样品组分不同化学组分应与待分离的样品组分不同化学组分应与待分离的样品组分不同 以免干扰样品组分的测定以免干扰样品组分的测定以免干扰样品组分的测定以免干扰样品组分的测定与样品中各组分不会发生相互作用无生物学效应 不干扰酶活性测定 不干扰免疫检测不干扰抗体制备(注射到小白鼠或大白兔中)现在常用的现在常用的两性电解质的性质两性电解质的性质两性电解质的性质两性电解质的性质 l966l966l966l966年年年年首首首首次次次次合合合合成成成成了了了了多多多多氨氨氨氨基基基基多多多多羧羧羧羧酸酸酸酸的的的的
42、异异异异构构构构体体体体和和和和同同同同系物系物系物系物(类似物类似物类似物类似物)两性电解质的合成不饱和酸(丙烯酸)与多乙烯多胺(五乙烯六胺)发生双健的加成反应而成调节酸和胺的比例，就可得到一系列的氨基与羧基不同比例的多氨基多羧酸可得到不同pH范围的载体两性电解质如pH 3-10;pH 3.5-5;pH 5-7;pH 6-8;pH 9-11LKB LKB LKB LKB AmpholineAmpholineAmpholineAmpholine 两性电解质两性电解质两性电解质两性电解质 pHpHpHpH梯度的形成梯度的形成梯度的形成梯度的形成 在在在在没没没没有有有有电电电电场场场场时时时时，两两两两性性性性电电电电解解解解质质质质溶溶溶溶液液液液的的的的pHpHpHpH值值值值大大大大约约约约是是是是该溶液该溶液该溶液该溶液pHpHpHpH范围的平均值范围的平均值范围的平均值范围的平均值当引入电场，两性电解质分子将向正极或负极迁移在电场下,所有的一系列的氨基/羧基比例不同的两性电解质分子（脂肪族多氨基多羧酸），最终到达其pI相同的位置短时间内在正、负极之间给出一个pH梯度