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1、武武 汉汉 生生 物物 医医 学学 研研 究究 院院WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES实验六实验六SDS-PAGE电泳电泳武汉生物医学研究院2013年4月3日 武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES实实 验验 目目 的的学习学习SDS-PAGE电泳的基本原理电泳的基本原理掌握垂直板电泳的操作方法掌握垂直板电泳的操作方法运用运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定测定蛋白质分子量及染色鉴定 武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF B
2、IOMEDICAL SCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理电泳的基本原理电泳电泳:带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相 反的电极移动，称为电泳。反的电极移动，称为电泳。正极正极负极负极带负电粒子带负电粒子带正电粒子带正电粒子 武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理电泳的基本原理 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。利用电泳和分子筛的
3、双重作用分离物质。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移率取决于它所带的净电荷的多少、分子的大小和形状等因素。如果用过量的还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇等）和十二烷基硫酸钠（缩写SDS）加热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将被还原，蛋白质-SDS复合物具有相同的电荷密度，并引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率不再受原带的电荷和形状的影响，而取决于相对分子质量的大小，电泳时纯粹靠凝胶的分子筛效应进行分离。武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理电泳的基本原理 Acr和Bis单独存在
4、或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。采用不同浓度的Acr、Bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理电泳的基本原理 武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF B
5、IOMEDICAL SCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理电泳的基本原理 武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理电泳的基本原理 武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理电泳的基本原理1.材料：前期实验中提取的蛋白2试剂：(1)30%丙烯酰胺丙烯酰胺(Acr)：称称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，加蒸馏水至，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中
6、，过滤后置棕色瓶中，4贮存可用贮存可用1-2月。月。(2)10%SDS(十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠)(3)1.5mol/l pH8.8 Tris-HCl缓冲液：缓冲液：称取称取Tris18.2g，加入加入50ml水，用水，用1mol/l盐酸调盐酸调 pH8.8，最后用蒸馏最后用蒸馏 水定容至水定容至100ml。(4)1.0mol/lpH6.8Tris-HCl缓冲液：缓冲液：称取称取Tris12.1g，加，加 入入50ml水，用水，用1mol/l盐酸调盐酸调 pH6.8，最后用蒸馏水定容至，最后用蒸馏水定容至100ml。(5)0.05mol/lpH8.0Tris-HCl缓冲液：缓冲液：称取称取
7、Tris0.6g，加入，加入50ml水，用水，用1mol/l盐酸调盐酸调 pH8.0，蒸馏水定容至，蒸馏水定容至100ml。武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理电泳的基本原理(6)10%过硫酸铵过硫酸铵(AP)(7)TEMED(四甲基乙二胺四甲基乙二胺)(8)上样缓冲液上样缓冲液：SDS(100mg)+巯基乙醇巯基乙醇(0.1ml)+溴酚蓝溴酚蓝(2mg)+甘油甘油(2g)+0.05mol/L pH8.0Tris-HCl(2ml)，最后定容至，最后定容至10ml。(9)固定液：固定液：
8、取取50%甲醇甲醇454ml，冰乙酸，冰乙酸46ml混匀。混匀。(10)染色液：染色液：称取考马斯亮蓝称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液，加上述固定液250ml，过滤后备用。过滤后备用。(11)脱色液：脱色液：冰乙酸冰乙酸75ml，甲醇，甲醇50ml，加蒸馏水定容至，加蒸馏水定容至1000ml。(12)电泳电泳缓冲液缓冲液:称称Tris6.0g，甘，甘 氨酸氨酸28.8g，加入，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定，加蒸馏水使其溶解后定 容至容至1000ml。武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCESSD
9、S-PAGE电泳的基本原理电泳的基本原理垂直板电泳装置垂直板电泳装置直流稳压电源直流稳压电源移液管移液管滤纸滤纸 微量注射器微量注射器大培养皿大培养皿3.实验设备实验设备 武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。SDS-PAGE电泳的操作方法电泳的操作方法1装配制胶用的玻璃板 武汉生物医学研究
10、院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES将做好的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭头向上。按弹簧夹，将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃的间隙内灌胶，放上梳子，待胶凝固。SDS-PAGE电泳的操作方法电泳的操作方法2.制分离胶和浓缩胶 武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES(1)制分离胶：按所需的浓度配制15分离胶分离胶。TEMED最后加，快速混匀后用移液枪灌胶，由固定位置灌入，注意不能有气泡；灌完分离胶后在胶面上小心加1毫升水封（注意不要冲坏胶面）
11、，等胶自然凝聚（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）。30%Acr-Bis Tris-HCl pH 8.8 10%SDSH2O10%APTEMED2.5 ml1.3 ml50 l1.1ml50 l2 lSDS-PAGE电泳的操作方法电泳的操作方法 武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES加入分离胶溶加入分离胶溶加入分离胶溶加入分离胶溶液液液液 pH 8.8pH 8.8封水或饱和封水或饱和封水或饱和封水或饱和正丁醇溶液正丁醇溶液正丁醇溶液正丁醇溶液出现明显界面时，出现明显界面时，分离胶凝聚完成（分离胶凝聚完成（mi
12、nh）倒出水或正丁醇，倒出水或正丁醇，并用滤纸吸干并用滤纸吸干v制备分离胶制备分离胶封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES(2)制浓缩胶：按所需的浓度配制5浓缩胶浓缩胶。30%Acr-Bis Tris-HCl pH 6.8 10%SDSH2O10%APTEMED0.5 ml0.38 ml30 l2.1ml30 l3 lSDS-PAGE电泳的操作方法电泳的操作方法 武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUT
13、ES OF BIOMEDICAL SCIENCES分离胶分离胶分离胶分离胶pH 8.8pH 8.8加入浓缩胶溶加入浓缩胶溶液液 pH 6.8v制备浓缩胶制备浓缩胶样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入,梳梳口处不得有气泡口处不得有气泡,梳底需梳底需水平。水平。插入样品梳插入样品梳 武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES取出制好的玻璃（连带胶），将玻璃放入电极架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向电极架，厚玻璃的箭头朝上，玻璃与红色橡胶条必须完全紧贴。（需同时放置两块制好的胶，如只使用一块则另一面须用提供的塑料板代替，注
14、意塑料板上的提示，必须使塑料板与橡胶条完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容器。SDS-PAGE电泳的操作方法电泳的操作方法3.武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES将底座的开关打开，并向外拨动透明的架子，使中间空隙增大，放入电极架。如图所示将电极架往下压（约12mm），使底面完全接触。SDS-PAGE电泳的操作方法电泳的操作方法4.武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES关上底座开关。放入电泳槽内，加上加样架加样。注意加样架与刚才制胶所用
15、的梳子齿数必须一致。SDS-PAGE电泳的操作方法电泳的操作方法5.武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES6加样：取蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样1030l。SDS-PAGE电泳的操作方法电泳的操作方法 武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES加入电极缓冲加入电极缓冲加入电极缓冲加入电极缓冲液液液液pH 8.3pH 8.3浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶pH 6.8pH 6.8通电通电通电通电分离胶分离胶分离胶分离胶pH 8.8p
16、H 8.8加入样品加入样品加入样品加入样品v上样及电泳上样及电泳开始电压恒定在开始电压恒定在开始电压恒定在开始电压恒定在80V80V，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为120V120V，溴酚，溴酚，溴酚，溴酚蓝距凝胶边缘约蓝距凝胶边缘约蓝距凝胶边缘约蓝距凝胶边缘约5mm5mm时，停止电泳。时，停止电泳。时，停止电泳。时，停止电泳。武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES7电泳：先恒压80V，待样品进入分离胶后，调电压为120V（恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，停止
17、电泳。8撬开玻璃板，将浓缩胶切掉,剥下凝胶，准备染色。9 凝胶染色：使用考马斯亮蓝R250染色。两块胶（小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖上盖子用微波炉加热约15-20秒，摇床振荡15分钟，回收染液至指定容器回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脱色液（25%乙醇，7.5%乙酸）脱色，用量和步骤与染色相同，脱色两次，每次10分钟。SDS-PAGE电泳的操作方法电泳的操作方法 武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES注意事项注意事项(1)Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩。(2)玻璃板
18、表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。(3)样品槽模板梳齿应平整光滑。(4)灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。(5)切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。(6)电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。(7)稀释5SDS/电泳缓冲液至1浓度灌入电泳槽，需800毫升。SDS-PAGE电泳的操作方法电泳的操作方法 武汉生物医学研究院武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES蛋白质分子量测定蛋白质分子量测定 标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。武武 汉汉 生生 物物 医医 学学 研研 究究 院院WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES请大家批评指正