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1、专题1 基因工程一、基因工程的概念一、基因工程的概念基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程实质实质结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人类需要的生物类型和生物产品人类需要的生物类型和生物产品剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重组基因重组 指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外体外DNADNA重组重组和和转基因转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生
2、物类型和生物产品。从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在由于基因工程是在DNADNA分子水平分子水平上进行设计和施工的，上进行设计和施工的，因此又叫做因此又叫做DNADNA重组技术重组技术。记一记记一记1.1 DNA1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具3DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具工欲善其事,必先利其器.想一想想一想:获得转基因抗虫棉需要做哪些工作呢获得转基因抗虫棉需要做哪些工作呢?实现这一精确的操作过程的工具是什么呢实现这一精确的操作过程的工具是什么呢?1.1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”(1)(1)来
3、源来源:(2)(2)化学本质：化学本质：(3)(3)作用作用 (4)(4)作用特点：作用特点：(5)(5)切割方式切割方式识别双链识别双链DNADNA分子的某种特定的核苷酸序列，并分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。二酯键断开。错位切：产生两个相同的错位切：产生两个相同的黏性末端黏性末端平切：形成平切：形成平末端平末端特异性特异性，即，即识别特定的脱氧核苷酸序列识别特定的脱氧核苷酸序列,切割切割特定位点。特定位点。主要从原核生物主要从原核生物蛋白质蛋白质 T磷酸二酯键1234512345 A7限制酶所
4、识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。图1-1 限制酶识别序列的中心轴线当限制酶当限制酶从识别序列的从识别序列的中心轴线处中心轴线处切开时，切开时，产生的是产生的是平末端平末端。当限制酶当限制酶从识别序列的从识别序列的中心轴线两侧中心轴线两侧切开时，切开时，产生的是产生的是黏性末端。黏性末端。黏性末端黏性末端 当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切中心轴线两侧切开时开时，被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切两条单链的切口，带有几个口
5、，带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正，他们之间正好好互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。EcoRI限制酶的切割：中轴线中轴线黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端在在G与与A之间切割之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。平末端平末端 当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线处切中心轴线处切开时开时，切开的，切开的DNADNA两条单链的切口，是平两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫整的，这样的切口叫平末端平末端。C C C G G GG G G C C CSmaI限制酶的切割：只能识别CCCGGG序列，并在C
6、和G之间切开。中轴线中轴线要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切点？可要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切点？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切点，产生四个黏性末端，两个。要切两个切点，产生四个黏性末端，两个。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来切割，会用同一种限制酶来切割，会怎样呢？怎样呢？会产生相同的黏性末端。会产生相同的黏性末端。是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成 重组的重组的DNADNA分子了分子了?实际还不够实际还不
7、够,还需要还需要DNADNA连接酶进行连接。连接酶进行连接。思考题：思考题：2、连接酶、连接酶“分子缝合针分子缝合针”种类：种类：作用部位：作用部位：EcoliDNA连接酶连接酶（黏性末端）（黏性末端）T4DNA连接酶连接酶（黏性末端和平末端黏性末端和平末端）是磷酸二酯键，是磷酸二酯键，将双链将双链将双链将双链 DNA DNA片段片段片段片段“缝合缝合缝合缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键之间的磷酸二酯键之间的磷酸二酯键之间的磷酸二酯键,这样一个重组的这样一个重组的这样一
8、个重组的这样一个重组的DNADNA分子就形成了分子就形成了分子就形成了分子就形成了。不是氢键。不是氢键。EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶与与T4DNAT4DNA连接酶比较连接酶比较连接酶比较连接酶比较：类型类型来源来源来源来源EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏
9、性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端(效率较低效率较低效率较低效率较低)相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别DNA聚合酶和聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？连接酶有何相同点和不同点？DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶连接连接DNADNA链链连接部位连接部位相同点相同点双链双链单链单链在两在两DNADNA片段之间形片段之间形成磷酸二酯键成磷酸二酯键将单个核苷酸加将单个核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片段的片段的3 3末端的末端的羟基上，形成磷羟基上，形成磷酸二酯键酸二酯键都能形成都能形成磷酸二酯键磷酸二酯键二者都由蛋白质构成二者都由蛋白质构成记一记记一记DN
10、ADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶区别区别1 1区别区别2 2相同点相同点DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶聚合酶1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的核酸片段上，接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键1)1)在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键2)2)以以一条一条DNADNA链为模板链为模板，将将将将单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链2)2)将将DNADNA双链上的双链上的两两个缺口同时
11、连接个缺口同时连接起来，起来，不需要模板不需要模板限制酶解旋酶区别限制性内切酶与解旋酶的区别限制性内切酶与解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键的磷酸二酯键将将DNADNA两条链的氢键两条链的氢键打开形成两条单链打开形成两条单链据右图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是（据右图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是（）A.限制性内切酶可以切断限制性内切酶可以切断a处，处，DNA连接酶可以连接连接酶可以连接a处处B.DNA连接连接酶可以连接酶可以连接a处处C.解旋酶可以使解旋酶可以使b处解开处解开D.连接连接b处的酶可以为处的酶可以为DNA连接酶连接酶D3 3、基因进入受
12、体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”（1 1）载体的作用）载体的作用u将将外源基因外源基因转移到转移到受体细胞受体细胞中去。中去。u运载体对运载体对外源基因外源基因进行大量复制。进行大量复制。（2）作为载体必须具备的条件）作为载体必须具备的条件u能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。u具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。u具有某些标记基因，便于进行筛选。具有某些标记基因，便于进行筛选。u必需是安全的，不会对受体必需是安全的，不会对受体细胞有害。细胞有害。u大小应适合，便于提取和操
13、作大小应适合，便于提取和操作记一记记一记（3）常用的载体）常用的载体质粒质粒噬菌体衍生物噬菌体衍生物动植物病毒动植物病毒常用的载体：质粒常用的载体：质粒复制起始的复制起始的复制起始的复制起始的一段序列一段序列一段序列一段序列有切割位点有切割位点有切割位点有切割位点有标记基因的有标记基因的有标记基因的有标记基因的存在，可用含存在，可用含存在，可用含存在，可用含氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别质粒存在于许多质粒存在于许多细菌细菌以及酵母菌等生物细以及酵母菌等生物细胞中胞中。是一种裸露的、。是一种裸露的、结构简单、独立于细结构简单、独立于细菌拟
14、核菌拟核DNA或细胞核或细胞核之外自我复制的很小之外自我复制的很小的双链环状的双链环状DNA分子分子不属于质粒被选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制、能复制（）B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点C、具有标记基因、具有标记基因D、它是环状、它是环状DNAD议一议议一议2 2、能否用、能否用、能否用、能否用SARSSARS病毒作为基因载体？病毒作为基因载体？病毒作为基因载体？病毒作为基因载体？3 3、作为载体，若没有切割位点将怎样？作为载体，若没有切割位点将怎样？作为载体，若没有切割位点将怎样？作为载体，若没有切割位点将怎样？4 4、携带目的基因的载体是否进入了受
15、体细胞，、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？如何鉴定？如何鉴定？如何鉴定？5 5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？将怎样？将怎样？将怎样？1 1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？、从化学组成来看，载体应含有什么成分？、从化学组成来看，载体应含有什么成分？、从化学组成来看，载体应含有什么成分？双链双链双链双链DNADNADNADNA不能不能不能不能不能进行不能进行不能进行不能
16、进行DNADNADNADNA的重组的重组的重组的重组载体上应有标记基因载体上应有标记基因载体上应有标记基因载体上应有标记基因可能造成基因丢失可能造成基因丢失可能造成基因丢失可能造成基因丢失思考与探究思考与探究1.1.限制酶在限制酶在DNADNA的任何部位都能将的任何部位都能将DNADNA切开吗？以下是四种不同限切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的制酶切割形成的DNADNA片段：片段：(1)(1)CTGCACTGCA(2)(2)ACAC (3)GC (3)GC G G TGTG CG CG（4 4）G G (5)(5)G G (6)(6)GCGC CTTAACTTAA ACGTC ACGTC
17、CGCG(7)GT(7)GT(8)AATTC(8)AATTC CA CA G G你能用你能用DNADNA连接酶将它们连接起来？连接酶将它们连接起来？2和7能连接形成ACGT TGCA；4和8能连接形成GAATTC CTTAAG；3和6能连接形成GCGC CGCG；1和5能连接形成CTGCAG GACGTC。272、为什么限制酶、为什么限制酶不能将自己的不能将自己的DNA分子剪切掉？分子剪切掉？1 1、DNADNA分子不具分子不具备该种限制酶的备该种限制酶的识别切割序列；识别切割序列；2 2、通过甲基化酶、通过甲基化酶将甲基转移到所将甲基转移到所识别序列的碱基识别序列的碱基上，使限制酶不上，使限
18、制酶不能切开。能切开。4.网上查询：DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？迄今为止，所发现的迄今为止，所发现的DNADNA连接酶连接酶都不具有连接单链都不具有连接单链DNADNA的能力，至于原因，的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链单链DNADNA的酶。的酶。29 真核生物的基因由编码区和非编码区组成，两边是非编码区（非编码序列）、中间是编码区（编码序列）。而中间的编码区也由编码序列和非编码序列相间排列组成，其中的编码序列称外显子、而非编码序列称内含子。原核生物的基因也有编码区、非编码区，但是编码区内是连续的编码区列。（注意在原核生物基
19、因中，没有外显子和内含子的概念，即你不能说原核生物的编码区全是外显子）这样的基因转录是，先以编码区其中一条链为模板合成mRNA，这就是前体mRNA，然后有些酶将那些内含子对应的序列切去，把外显子对应的mRNA的序列链接在一起，这就是成熟的mRNA，这就是翻译蛋白质的直接模板了。核糖体结合在上面，并沿其滑动。当遇到AUG（真核生物的起始密码子）或者GUG（原核生物的起始密码子）时，肽链的合成开始，当遇到UAA、UAG、UGA（终止密码子）的时候，肽链合成终止。一句话：编码区（外显子、内含子）和非编码区是基因的结构。起始、终止密码子是mRNA的三个为一组的碱基。无论真核细胞还是原核细胞其基因均有编码区（能转录mRNA,进而编码蛋白质)与非编码区(不能转录mRNA,不能编码蛋白质），真核细胞基因的编码区可分为外显子（可编码蛋白质)、内含子(不能编码蛋白质）。而密码子位于mRNA上，起始密码子有AUG（决定甲硫氨酸）和GUG（决定缬氨酸），而终止密码子则有UAA、UAG、UGA，不决定氨基酸