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1、19.1 9.1 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理 一、概述：一、概述：比色法：比色法：比较溶液比较溶液颜色的深浅颜色的深浅确定组分含量的一种确定组分含量的一种 方法。方法。吸光光度法是基于吸光光度法是基于被测物质的分子对光具被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。而建立起来的分析方法。2经证明：不论溶液有无颜色，当一定波长的光通过经证明：不论溶液有无颜色，当一定波长的光通过该溶液时，总有一定程度的吸光作用。并且随单该溶液时，总有一定程度的吸光作用。并且随单位体积内溶液中该物质的质点数目增多，对光的位体积内溶液中该物质的质点数目增多，对光的吸收越强
2、。吸收越强。分光光度法：分光光度法：测量物质对一定波长光线的吸测量物质对一定波长光线的吸收程度确定组分含量的方法。收程度确定组分含量的方法。3特点：特点：灵敏度高：灵敏度高：测定下限可达测定下限可达10105 510106 6molmolL L-1-1,10 10-4-4%1010-5-5%准确度准确度能够满足微量组分的测定要求：能够满足微量组分的测定要求：相对误差相对误差2 25 5 操作简便快速操作简便快速应用广泛应用广泛4化学分析与仪器分析方法比较化学分析与仪器分析方法比较化学分析化学分析：常量组分：常量组分(1%),Er 0.1%0.2%依据化学反应依据化学反应,使用玻璃仪器使用玻璃仪
3、器 准确度高准确度高仪器分析仪器分析：微量组分：微量组分(10104 4*选择性好选择性好 显色剂在测定波长处无明显吸收。显色剂在测定波长处无明显吸收。对照性好对照性好,maxmax60 nm.60 nm.*反应生成的有色化合物反应生成的有色化合物组成恒定，稳定组成恒定，稳定。*显色条件易于控制，显色条件易于控制，重现性好重现性好。491.显色剂用量显色剂用量（c c(M)(M)、pHpH一定）一定）9.3.2 显色条件的确定显色条件的确定c(R)c(R)c(R)Fe(SCN)n3-nMo(SCN)32+浅红浅红Mo(SCN)5 橙红橙红Mo(SCN)6-浅红浅红502.显色反应酸度显色反应酸
4、度（c c(M)(M)、c c(R)(R)一定一定）pHpH1pH63 吸光光度法中，仪器测量不准也是误差的主吸光光度法中，仪器测量不准也是误差的主要来源。要来源。A=-lgT=bc A=-lgT=bc 透过率读数误差透过率读数误差 T基本是个常数，基本是个常数，因为因为T的标尺是均匀的，的标尺是均匀的，T是由仪器刻度读数不可靠引起的误差，和是由仪器刻度读数不可靠引起的误差，和T的大小无关的大小无关 吸光度读数误差吸光度读数误差 A A是随着是随着A A的不同而变化，因为的不同而变化，因为A A的刻度的刻度标尺是不均匀的，标尺是不均匀的，AA随着随着A A的增大而增大的增大而增大64 不同的吸
5、光度数值不同的吸光度数值A下，吸光度读数误差带来的测定浓下，吸光度读数误差带来的测定浓度误差度误差dc/c是不同的是不同的65 假设假设T T为为0.5%0.5%，绘制不同透过率下浓度相对误，绘制不同透过率下浓度相对误差变化曲线如图差变化曲线如图9-169-16（p254p254）：）：T T过高或过低，过高或过低，dc/cdc/c都是很大的，都是很大的，T T在适宜的范围内测量误差才是在适宜的范围内测量误差才是可以接受的可以接受的 利用（利用（9-59-5）公式令其导数为零，求出：）公式令其导数为零，求出：T=0.368T=0.368（A=0.434A=0.434）浓度误差最小，约为）浓度误
6、差最小，约为1.4%1.4%。661086420204060800.70.40.20.1AT%Er(36.8)0.434浓度测浓度测量的相量的相对误差对误差与与T(或或A)的关的关系系实际工作中，应控制实际工作中，应控制T在在70 10,A在在0.151.0之间之间 (调调c,b,)67调整比色皿厚度和取样量等达到调整比色皿厚度和取样量等达到浓度误差大小和浓度误差大小和T/AT/A的读数范围有关：的读数范围有关：T=70T=7010%/A=0.1510%/A=0.151.01.0时，时，浓度测量误差为浓度测量误差为1.4-2.2%1.4-2.2%；如果要求准确度高些，如果要求准确度高些，可控制
7、可控制T=65-20%/A=0.2-0.7T=65-20%/A=0.2-0.768 吸光光度法的应用吸光光度法的应用1.单一组分测定单一组分测定（标准曲线法）（标准曲线法）1)金属离子金属离子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟丁二酮肟,Co-钴试剂钴试剂2)磷的测定磷的测定:DNA中含中含P9.2%,RNA中含中含P9.5%,可得核酸量可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄磷钼黄(小小)Sn2+磷钼磷钼(V)蓝蓝(大大)692.2.多组分的测定多组分的测定a)在 1处测组分处测组分x,在 2处测组分处测组
8、分yb)在 1处测组分处测组分x;在在 2处测总吸处测总吸收收,扣除扣除x吸收吸收,可求可求y c)x,y组分不能直接测定组分不能直接测定 P254A1=x 1 bcx+y 1 bcy (在 1处测得处测得A1)A2=x 2 bcx+y 2 bcy (在 2处测得处测得A2)x 1,y 1,x 2,y 2由由x,y纯液纯液 在在 1,2处分别测得处分别测得703)蛋白质测定蛋白质测定溴甲酚绿、考马司亮蓝等溴甲酚绿、考马司亮蓝等4)氨基酸测定氨基酸测定茚三酮茚三酮(紫色化合物紫色化合物)5)水质检测水质检测:NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+-6)药物含量测定药物含量测定比吸光系数定量；荷移比吸光系数定量；荷移光谱法测定光谱法测定.7)紫外吸收紫外吸收(UV):NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。苯丙氨酸、蛋白质等。精品课件精品课件！精品课件精品课件！73 4.4.配合物组成的测定配合物组成的测定3.3.一元弱酸离解常数的测定一元弱酸离解常数的测定 5.双波长分光光度法消除干扰双波长分光光度法消除干扰 6.导数分光光度法导数分光光度法