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1、第九章第九章 吸光光度法吸光光度法9.1 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理9.2 光度计及其基本部件光度计及其基本部件9.3 显色反应与显色条件的选择显色反应与显色条件的选择9.4 吸光度测量条件的选择吸光度测量条件的选择9.5 吸光光度法的应用吸光光度法的应用9.1.1 物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收不同颜色的可见光波长及其互补光不同颜色的可见光波长及其互补光/nm颜色互补光400-450450-480480-490490-500500-560560-580580-610610-650650-760不同物质吸收光谱的形状以及不同物质吸收光谱的形状以及 max不同不同定性分析
2、的基础定性分析的基础同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，状相同，Amax不同不同定量分析的基础定量分析的基础光的吸收基本定律光的吸收基本定律:朗伯朗伯-比尔定律比尔定律朗伯定律朗伯定律:(1760)(1760)A=lg(I0/It)=k2b意义意义:当入射光的当入射光的,吸光物质的吸光物质的c和溶液的和溶液的t一定时一定时,溶液的吸光度溶液的吸光度A与液层厚度与液层厚度b成正比成正比.光吸收基本定律光吸收基本定律:朗伯朗伯-比尔定律比尔定律比尔定律比尔定律(1852)1852)A=lg(I0/It)=k4c意义意义:当入射光的当入射光的,液层厚度液层厚度
3、b和溶液的和溶液的t一定时一定时,溶液的吸光度溶液的吸光度A与吸光物质的与吸光物质的c成正比成正比.光吸收基本定律光吸收基本定律:朗伯朗伯-比尔定律比尔定律意义意义:当一束平行单色光通过均匀、非当一束平行单色光通过均匀、非散射的溶液时，其吸光度与溶液的散射的溶液时，其吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比浓度和液层厚度的乘积成正比.A=lg(I0/It)=kbcT透光率（透射比）透光率（透射比）（Transmittance）IoIt入射光入射光透过光透过光A=lg(I0/It)=lg(1/T)=-lgT=kbc吸光度吸光度A、透射比、透射比T与浓度与浓度c的关系的关系ATcA=kbc1968
4、年年IUPAC规定用规定用4个量个量 A,T,bA/bcLmol-1cm-1 cm molL-1 当吸光物质浓度为当吸光物质浓度为1molL-1,液池厚液池厚1cm时，一时，一定波长的光通过溶液时的吸光度值。定波长的光通过溶液时的吸光度值。是物质本性决定的，表示灵敏度。是物质本性决定的，表示灵敏度。5105 高高物理意义：物理意义：最常用的形式：最常用的形式：AbcA、T、b、k的名称的名称AkbcA 吸光度吸光度 Absorbance光密度光密度 Optical Density 用用D或或O.D表示表示消光度消光度 Extinction 用用E表示表示T 透射比透射比 Transmissio
5、n 透光度（率）透光度（率）Transmittanceb 样品光程样品光程（Sample Path Length),单位为单位为cm。一般为吸收池厚度。一般为吸收池厚度。K 吸光系数吸光系数 Absorptivity 消光系数消光系数 Extinction Coefficient 吸收指数吸收指数 Absorbancy Index当当c的单位用的单位用gL-1表示时，用表示时，用a表示，表示，Aabc当当c的单位用的单位用molL-1表示时，用表示时，用表示表示.A bc 摩尔吸光系数摩尔吸光系数 Molar Absorptivity 或称摩尔吸光指数或称摩尔吸光指数 Molar Absorb
6、ancy Index当当c的单位用的单位用g100mL-1表示时，用表示时，用 表示，表示，A bc，叫做比消光系数叫做比消光系数(Specific Extinction Coefficient).吸光度与光程的关系吸光度与光程的关系 A=bc 0.00光源光源检测器检测器吸光度吸光度A=bc0.22光源光源检测器检测器b样品样品吸光度吸光度A=bc 吸光度吸光度0.44光源光源检测器检测器样品样品A=bc 吸光度吸光度0.66光源光源检测器检测器样品样品吸光度与浓度的关系吸光度与浓度的关系 A=bc 吸光度吸光度0.00光源光源检测器检测器A=bc 吸光度吸光度0.42光源光源检测器检测器b
7、样品样品吸光度与波长的关系吸光度与波长的关系A=bc 吸光度吸光度0.00光源光源检测器检测器吸光度与波长的关系吸光度与波长的关系 A=bc 吸光度吸光度0.00光源光源检测器检测器b吸光度与波长的关系吸光度与波长的关系 A=bc 吸光度吸光度0.80光源光源检测器检测器b9.1.3 偏离朗伯偏离朗伯-比尔定律的原因比尔定律的原因当当溶质浓度很高（一般溶质浓度很高（一般0.01mol/L)时，时，分子之间分子之间的距离与分子大小相比，静电作用影响摩尔吸光系的距离与分子大小相比，静电作用影响摩尔吸光系数的偏离数的偏离样品中粒子的散射样品中粒子的散射待测样品在测定波长下发荧光或磷光待测样品在测定波
8、长下发荧光或磷光在高浓度的电解质溶液中，折射指数发生变化在高浓度的电解质溶液中，折射指数发生变化随着浓度的增加，化学平衡发生移动随着浓度的增加，化学平衡发生移动非单色光发射，尽量选用非单色光发射，尽量选用 max处处测定测定杂散光杂散光光不纯引起的对光不纯引起的对Beer定律的偏离（定律的偏离（1）2 max max 2 max处，处，基本不变基本不变 2处，处，变化较大变化较大AA/nmc/mol/L应尽量选择应尽量选择 max作为测定波长作为测定波长（？）（？）吸光度的加和性吸光度的加和性 在含有多组分体系的吸光分析中，在含有多组分体系的吸光分析中，往往各组分对同一波长的光有吸收。溶往往各
9、组分对同一波长的光有吸收。溶液的吸光度等于各组分的吸光度之和：液的吸光度等于各组分的吸光度之和：A=A1+A2+An目视比色法目视比色法 通过眼睛观察比较溶液深浅来确定物通过眼睛观察比较溶液深浅来确定物质含量的方法。质含量的方法。空空白白c1c2c3c4浓度增大浓度增大观察方向观察方向722722型分光光度计结构方框图型分光光度计结构方框图9.2 光度分析的方法和仪器光度分析的方法和仪器分光光度法的基本部件分光光度法的基本部件光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测系统检测系统稳压电源稳压电源分光光度计的主要部件（分光光度计的主要部件（1 1）光源光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够：发出所
10、需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度且不随的光强度且不随而改变。稳定。而改变。稳定。可见光区：钨灯，碘钨灯可见光区：钨灯，碘钨灯 紫外区：氢灯，氘灯紫外区：氢灯，氘灯单色器单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。装置。分光元件：滤光片，棱镜，光栅分光元件：滤光片，棱镜，光栅吸收池吸收池：(比色皿比色皿)用于盛待测及参比溶液。用于盛待测及参比溶液。可见光区：光学玻璃可见光区：光学玻璃 紫外区：石英紫外区：石英分光光度计的主要部件（分光光度计的主要部件（2 2）检测器检测器：利用光电效应，将光强度转换成：利用光电效应，将光强度转换成 电流讯号。电流
11、讯号。光电池，光电管，光电倍增管光电池，光电管，光电倍增管检流计检流计（指示器）：将信号以适当方式显示（指示器）：将信号以适当方式显示 或记录。或记录。低档仪器：刻度显示低档仪器：刻度显示 中高档仪器：记录仪，数字显示中高档仪器：记录仪，数字显示分光元件（分光元件（1 1）棱镜：棱镜：依据不同波长光通过棱镜时有不同的依据不同波长光通过棱镜时有不同的 折射率而将不同波长的光分开。折射率而将不同波长的光分开。玻璃：玻璃：3503200nm石英：石英：1854000nm入射狭缝入射狭缝准直透镜准直透镜棱镜棱镜聚焦透镜聚焦透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫单色器单色器1 12 2滤光片滤光片（用在光
12、电比色计上）（用在光电比色计上）吸收滤光片吸收滤光片：只允许指定的窄范围波长光通过，：只允许指定的窄范围波长光通过，其他波长的光均被吸收的滤光片其他波长的光均被吸收的滤光片(用于可见光区用于可见光区)。分光元件分光元件（3 3）/nmT T%标称波长标称波长带通带通半高宽半高宽滤光片颜色滤光片颜色 max溶液颜色溶液颜色红红650 蓝绿蓝绿绿绿530 红紫红紫蓝蓝440 黄黄国产国产581581型光电比色计型光电比色计检测器检测器-硒光电池（硒光电池（Barrier-layer photocell）适用于适用于300-800 nm,在在500-600 nm范围最灵敏。范围最灵敏。Se阴极阴极A
13、u，Ag半导体半导体h 阳极阳极检测器检测器-光电管光电管h（片）（片）检测器检测器-光电管光电管红敏管红敏管 625-1000 nm蓝敏管蓝敏管 200-625 nmNi环（片）环（片）碱金属碱金属光敏阴极光敏阴极h 9.3 显色反应及显色条件的选择显色反应及显色条件的选择 9.3.1 显色反应显色反应 反应条件的确定反应条件的确定 测定中的干扰以及消除方法测定中的干扰以及消除方法显色反应的选择显色反应的选择v灵敏度高，一般灵敏度高，一般10104 4v选择性好选择性好v显色剂在测定波长处无明显吸收。显色剂在测定波长处无明显吸收。对照性好对照性好,maxmax60 nm.60 nm.v反应生
14、成的有色化合物组成恒定，稳定。反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。v显色条件易于控制，重现性好。显色条件易于控制，重现性好。9.3 显色反应及显色条件的选择显色反应及显色条件的选择显色条件的选择显色条件的选择1.确定显色剂用量确定显色剂用量（c(M)、pH一定）一定）c(R)c(R)c(R)2.确定显色反应酸度确定显色反应酸度（c(M)、c(R)一定）一定）pH1pH cs Ax=bcx,As=bcs A=A=Ax-As=b(cx-cs)=b c则则 cx=cs+c高吸高吸收法收法1.3A 1.0A0.30Sx示差光度法标尺扩展原理示差光度法标尺扩展原理A 5示差光度法示差光度法cA正常示差A
15、x=1.30,As=1.00Tx=5.0%,Ts=10%Tx=50%,Ts=100%Ax=0.30,As=0.0 扩大扩大10倍倍测量的相对误差测量的相对误差示差光度法要求光源的发射强度要足够强。示差光度法要求光源的发射强度要足够强。多组分的测定多组分的测定a)在 1处测处测组分组分x,在 2处测组分处测组分yb)在 1处测组分处测组分xc)x,y组分不能直接测定组分不能直接测定A1=xl l1bcx+yl l1bcy(在 1处测得处测得A1)A2=xl l2bcx+yl l2bcy(在 2处测得处测得A2)xl l1,yl l1,xl l2,yl l2由由x,y标液标液 在在 1,2处分别测
16、得处分别测得 光度滴定光度滴定V1V2V(NaOH)/mLNaOH滴定滴定 对硝基酚对硝基酚 pKa=7.15 间硝基酚间硝基酚 pKa=8.39 pKa=1.24对硝基酚对硝基酚间硝基酚间硝基酚典型的光度滴定曲线典型的光度滴定曲线VspVspVspVsp依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。终点的滴定分析方法。一元弱酸离解常数的测定一元弱酸离解常数的测定HL HL （HL、L颜色不同）颜色不同）KaH+L/HL高酸度下，几乎全部以高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得存在，可测得AHLHLc(HL)；低酸度下，几乎全部以低酸度下，几乎全部以L存
17、在，可测得存在，可测得AL Lc(HL).代入整理：代入整理：HLL或络合物组成的测定络合物组成的测定-连续变化法连续变化法M:R=1:10.50.33cR/cfcR/cfM:R=1:20.00.20.40.60.81.01.00.80.60.40.20.0络合物组成的测定络合物组成的测定摩尔比法摩尔比法固定固定cMM+R MR吸光光度法吸光光度法特点特点 灵敏度高：测定下限可达灵敏度高：测定下限可达105106mol/L,10-4%10-5%准确度能够满足微量组分的测定要求：准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差相对误差25（12）操作简便快速操作简便快速应用广泛应用广泛 吸光光度法是基于被测物质的分子对光具吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。