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1、第二章 微生物的觀察與檢驗 顯微鏡構造及使用微生物染色微生物鑑定第一節顯微鏡構造及使用n顯微鏡的種類與功能n顯微鏡若依觀察方法的差異性，則可區分為明視野顯微鏡、暗視野顯微鏡、位相差顯微鏡、干擾相差顯微鏡、偏光顯微鏡、紫外光顯微鏡、螢光顯微鏡、雷射共軛焦顯微鏡、解剖顯微鏡與電子顯微鏡等特定功能之顯微鏡。n光學顯微鏡n原理n光學顯微鏡是由二組凸透鏡（物鏡、目鏡）組成。欲觀察的物體先經物鏡聚成一放大的倒立實像，該倒立實像於顯微鏡成像過程中僅屬於過渡性的影像，此倒立實像恰巧落於目鏡的焦點內，所以當人眼緊靠目鏡的出視孔時，可觀察到倒立實像經目鏡放大後的更加放大之倒立虛像。n放大率n顯微鏡的放大功能原理是
2、將物鏡和目鏡做適當地調整組合，以放大欲觀察物體（標本）之影像。n物鏡的功能為使被觀察物體成一個倒立放大的實像。低倍鏡常用於搜索觀察對象及觀察標本全貌，高倍鏡則用於觀察標本某部分或較細微的結構，油鏡則常用於觀察微生物或動植物更細微的結構。n目鏡的功能則是將物鏡形成的實像再一次放大成虛像。n顯微鏡總放大率物鏡之放大倍數目鏡之放大倍數。n解像力n解像力是指鏡頭能清楚分辨二相近物體間最小距離的能力。若鏡頭中有二個物體接近到幾乎重疊時，此時通過物體的光線會產生繞射，進而在物體周圍產生一系列光圈，使得二物體無法被清楚辨識，此即表示鏡頭對該二物體已失去解像力。n顯微鏡解像力可由下列數學公式表示：n式中D值愈
3、小，表示顯微鏡的解像力愈好，亦即物體可視的二點最短距離很小時仍可以被辨識。由式(1)可知，顯微鏡解像力與入射光波長、光入射角、介質的折射率有關。n入射光光源波長：值愈大，D值愈大；值愈小，D值愈小，亦即入射光波長愈長，顯微鏡辨識物體的解像力愈差；入射光波長愈短，顯微鏡辨識物體的解像力愈好。n光入射角：sin值愈小，D值愈大；sin值愈大，D值愈小，亦即光入射角愈小，顯微鏡辨識物體的解像力愈差；光入射角愈大，顯微鏡辨識物體的解像力愈好。n顯微鏡解像力有實質幫助的光入射角度最大值僅為140。n介質的折射率：n值愈小，D值愈大；n值愈大，D值愈小，亦即標本與物鏡間介質的折射率愈小，顯微鏡辨識物體之解
4、像力愈差；標本與物鏡間介質的折射率愈大，顯微鏡辨識物體的解像力愈好。n數值孔徑(numerical aperture)：亦稱光口徑，是表示經由聚光鏡至物鏡所產生錐狀光圈的量度。n電子顯微鏡n電子顯微鏡與光學顯微鏡的原理極為相似，差異在於電子顯微鏡以電子束取代光線，電磁鐵透鏡取代玻璃透鏡，由於電子輻射的波長比可見光小很多，故大幅提昇解像力（普通光學顯微的最小解像距離為0.2m，電子顯微鏡可達到0.001m，亦即10）。光學顯微鏡1.明視野顯微鏡2.暗視野顯微鏡3.位相差顯微鏡4.螢光顯微鏡n光學顯微鏡n明視野顯微鏡n明視野顯微鏡是以自然光或鎢絲燈（電燈）為光源照射樣本，通過與未通過樣本之光線皆進
5、入物鏡中，使得樣本本身呈陰暗，視野背景為明亮狀態。n暗視野顯微鏡n暗視野顯微鏡與明視野顯微鏡相似，皆利用可見光為光源照射樣本，唯一差異在於暗視野顯微鏡的聚光鏡中央有暗視環，使照明光線不直接進入物鏡，只允許被樣本散射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景為陰暗，物體的邊緣為明亮。n位相差顯微鏡n位相差顯微鏡利用菌體內各部位密度的差異，進而對入射光線產生不同的散射，使得活細胞內不同部位產生明顯對比，藉此辨別活細胞內各種構造。位相差顯微鏡較普通光學顯微鏡多了環狀光圈與位相板（位相移動片）等構造。n螢光顯微鏡n螢光顯微鏡是藉由樣本發出的光來達到觀察之目的。某些物質經激發光照射後會產生螢光，無法產生螢光的
6、物質亦可利用螢光染劑與欲觀察的物質結合後產生。螢光顯微鏡包含光源、激發濾光片、螢光樣本與阻斷濾光片等基本元件。n電子顯微鏡n掃描式電子顯微鏡n穿透式電子顯微鏡n掃描式電子顯微鏡n掃描式電子顯微鏡主要用於用來觀察樣本的表面結構。以掃描式電子顯微鏡觀察微生物菌相時須經過煩瑣之前處理過程，其過程包括菌體收集、樣本（菌體）固定、樣本脫水、臨界乾燥、鑲嵌及鍍金。n穿透式電子顯微鏡n穿透式電子顯微鏡多應用於細胞內結構之觀察。穿透式電子顯微鏡樣本製備包括樣本初步固定、樣本清洗、二次固定、脫水、過渡溶劑滲透、塑膠滲透、包埋及聚合。電子顯微鏡放線菌的孢子鏈第二節 微生物染色1.染色目的2.染色原理3.染劑4.染
7、色方法 (1)簡單染色 (2)鑑別染色革蘭氏染色(Gram stain)應用的溶液反應及細菌外觀 G+G-Time1.結晶紫(主染劑)細胞染成紫色細胞染成紫色60 sec2.碘液(媒染劑)細胞內形成CV-I複合物，紫色細胞內形成CV-I複合物，紫色60 sec3.乙醇(脫色劑)細胞壁脫水，發生多孔性收縮，降低CV-I滲出細胞，紫色脂質抽出，增加多孔性，CV-I從細胞移出，無色30 sec4.番紅(對比染劑)細胞不受影響發生染色而變粉紅色30 sec結核桿菌與抗酸性染色n結核桿菌不會馬上致命，但具有高度傳染力的病患透過飛沫傳染，擴散率相當高，快速檢驗患者並與以隔離是相當重要的。結核病大都是結核桿
8、菌引起的，由於結核桿菌細胞膜上的脂質比其他細菌豐富，經染色後不易被酸性的酒精洗除脂質而退色，故名抗酸性染色。因此抗酸性染色為初步辨識結合桿菌的方法之一。何謂酸性酒精？含有3%鹽酸及9095%乙醇。微生物檢驗1.顯微鏡觀察2.測定影響微生物生長因子 (1)物理因子 (2)化學因子 a.能源 b.碳源 c.氮源第三節微生物檢驗方法1.微生物的定性觀察2.微生物大小的量測3.總菌數測定4.大腸菌類數目微生物大小的量測鏡臺測微計總菌數測定1.直接計數法(cells/ml，filament/ml，unit/ml)2.間接計數法(平板計數法，CFU/ml)CFU:colony forming unit血球計數器:細菌、小型單細胞藻Sedgwick-Rafter(S-R)counting cell：藻類計數