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1、细菌的培养与分离技术考点O基本条件O细菌的接种与分离技术 细菌培养的方法 细菌的生长现象 细菌L型的检查【内容讲解】细菌培养是将细菌接种到培养基内，并在适当的环境内，使细菌生长和繁殖。分离培养是指从标本中培养出细菌或者从混有多种细菌的标本中将各个菌种分别同时培养出来。一、基本条件（一）细菌实验室（二）无菌实验室（三）基本设备和器具（-）细菌实验室标本接种、培养、分离、鉴定及药敏试验等工作都要在此完成。1 .细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。且室内禁用风扇，避免细菌的播散。2 .细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面1m处，每天开始工作前照射20min。对其 消毒
2、效果要定期检查，及时更换失效的灯管。3 .室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。同时还应备有供工作人员浸手用 的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等。4 .室内操作台须每H用消毒剂擦洗，地面至少周用消毒剂擦洗1次。5 .对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。同时要对用过的物品及时进 行灭菌处理。6 .细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。同时室内应设置必要的消防设备。（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。1 .无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。2 .用前应以
3、紫外线消毒30min,定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。3 .在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他 操作。4 .无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专川鞋，操作时戴口罩，随时保证室 内的无菌状态。5 .条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的操作。超净工作台应选择垂直气流 通风方式。6 .无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。（三）基本设备和器具温箱、CO2培养箱、厌氧培养设备；显微镜：高压蒸气灭菌器、干烤箱；冰箱和冷藏柜；接种器具，包括接种环和接种针；pH计；火焰灯或酒精灯；平皿、试管、吸管等玻璃器皿，
4、以及离心机、天平等。二、细菌的接种与分离技术选择好合适的培养基，根据待检标本的来源、培养FI的及所使用培养基的性状，采用不同的接种方法。平板划线分离法连续划线分离法性要用于杂菌不多的标本。分区划线分离法1适用于杂菌量较多的标本。1斜面接种法要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。液体接种法（避免气溶胶的产生）多用于些液体生化试验管的接种。11穿刺接种法此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。愉注平板法测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。涂布接种法常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。接种分离法I用途三、细菌培养的方法（-）需氧培养法（二）二氧化
5、碳培养法（三）厌氧培养法（一）需氧培养法临床细菌室最常用的培养方法，适于一-般需氧和兼性厌氧菌的培养。置于35c温箱中孵育1824h。（二）二氧化碳培养法有些细菌初次分离培养时须置5%10%C（L环境才能生长良好。1 .二氧化碳培养箱：是一台特制的培养箱，既能调节C0?的含量，又能调节所需的温度。CO?从钢瓶通 过培养箱的（:运送管进入培养箱内，调节好所需C02浓度自动控制器后，将接种好的培养基直接放入培养 箱中培养即可。适于大型实验室应用。2 .烛缸法：将已接种好的培养基置干燥器内，并放入点燃的蜡烛。干燥器盖的边缘涂上凡士林，盖上 盖子，烛光经几分钟后自行熄灭，此时干燥器内CO?含量约占5%
6、10%,然后将干燥器放入35温箱内培养。 培养时间-一般为1824h,少数菌种需培养37d或更长。3 .化学法：按每升容积加入碳酸氢钠0.4g和浓盐酸0.35ml的比例，分别置于容器内。（三）厌氧培养法适用于专性厌氧菌和兼性厌氧菌的培养。常用的厌氧培养法有：疱肉培养基法；焦性没食没酸法；厌氧罐法；气袋法：厌手套箱法。四、细菌的生长现象（-）细菌在固体培养基上的生长现象 （-）细菌在液体培养基中的生长现象 （三）细菌在半固体培养基中的生长现象 （一）细菌在固体培养基上的生长现象1 .观察菌落2 .血琼脂上的溶血3 .气味4 .色素1 .观察菌落菌落特征包括大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明
7、度和粘度等。根据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为三型：（1）光滑型（S型）菌落（2）粗糙型（R型）菌落（3）粘液型（M型）菌落2 .血琼脂上的溶血a溶血：又叫草绿色溶血，菌落周围血培养基变为绿色环状。B溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的环。丫溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化；红细胞没有溶解或无缺损。 双环：上层溶血环，内层为B溶血，外层为a溶血。如产气荚膜梭菌。3 .气味通过某些细菌在平皿培养基上代谢活动产生的气味，有助于细菌的鉴定。如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦气味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、放线菌 （泥土味）等。（二）细菌在液体培养基中的生长现
8、象浑浊生长：大多数细菌。沉淀生长：少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌。菌膜生长（表面生长）：专性需氧菌如枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌。（三）细菌在半固体培养基中的生长现象半固体培养基用于观察细菌的动力。O有鞭毛的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见那毛状或玄雾状浑浊生. 氐为动力阳性。O无鞭毛的细菌只沿穿刺线呈明显的线状生长，为动力试验阴性。五、细菌L型的检查表现为形态多形性、染色不确定性、可滤过性、渗透压敏感性，生化反应减弱特性以及对内酰胺类 和其他作用细胞壁抗生素的抵抗性。1 .标本采集应尽量采集无杂菌污染的组织或体液标本。胸水、腹水及尿液标本，应加2
9、0粉蔗糖无菌溶液,以保持高渗；血液标本应接种高渗肉汤增菌培养。2 .培养方法(1) L型检查程序：将标本接种到高渗肉汤增菌培养I7天，然后转种L型平板和血平板37C培养27天。典型菌落为“荷包蛋”样,但从患者标本中新分离的L型菌落常不典型，多呈颗粒型菌落，涂片染色 为多形性。(2)检验报告：血平板无菌生长，L型平板有菌落生长，可报告检出细菌L型；血平板中菌落细小，不易刮下。涂片检查细菌呈多形性，细胞壁缺损，I.型平板中有L型菌落，报告 检出L型；血平板及L型平板均有菌落生长。涂片有原菌及L型两种形态特征，可报告细菌型及L型同时存在, 并分别作药敏试验以供临床用药参考。【例题】单个细菌在固体培养
10、基上生长可形成A.菌丝B.菌落C.菌团D.菌苔E.菌膜【正确答案】B【例题】尿液标本作L型菌培养时，培养基中加入20%蔗糖的原因是A.提供高营养B.使尿中蛋白质变性C.稀释尿液D.保持高渗环境E.中和尿液的酸度【正确答案】D【例题】多用于含细菌最较多的标本的接种方法是A.分区划线分离法B.琼脂斜面培养基接种法C.半固体培养基接种法I).液体培养基接种法E.倾注平板法【正确答案】A【例题】关于平板划线分离培养法，叙述错误的是A.适用于临床标本的分离培养B.目的是使标本中的细菌各自形成单菌落C.常用划线方式为平板分区划线D.接种细菌越多越好E.接种时斜持平板(45 )【正确答案】1)【例题】下列细菌实验室一般注意事项，错误的是A.穿着专用白大衣、帽B.操作中不应谈话C.养成在室内手不触及口、面、发的习惯D.除接电话等紧急情况下，离室前必须消毒液洗手E.室内不准跑动，以免引起风动【正确答案】D【例题】下列方法与检查细菌动力无关的是A.压滴法B.鞭毛染色C.半固体穿刺I).革兰染色E.悬滴标本镜检【正确答案】D本章小结：一、细菌分离培养的基本条件 二、细菌的接种与分离技术 三、细菌培养的方法四、细菌的生长现象 五、细菌L型的检查