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1、会计学1常用分子生物学技术的原理及其应用常用分子生物学技术的原理及其应用常用分子生物学技术的常用分子生物学技术的原理及其应用原理及其应用第第 二十二十 章章第1页/共47页第一节分子杂交与印迹技术第2页/共47页n核酸分子杂交核酸分子杂交在在DNA复复性性过过程程中中，如如果果把把不不同同来来源源的的DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA单单链链与与RNA单单链链放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可以在不同的分子之间形成杂化双链以在不同的分子之间形成杂化双链。一、分子杂交和印迹技
2、术的原理一、分子杂交和印迹技术的原理4第3页/共47页复性复性RNADNA5第4页/共47页第5页/共47页用放射性核素、生物素或荧光染料标记用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为为“探针探针”，探针可以与固定在，探针可以与固定在NC膜上的核膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。（二）探针技术（二）探针技术7第6页/共47页8分子杂交实验第7页/共47页9放射自显影照片第8页/共47页二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹印迹(Sout
3、hern blotting)（二）（二）RNA印迹印迹(Northern blotting)（三）蛋白质的印迹（三）蛋白质的印迹(Western blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。10第9页/共47页11三种印迹技术的比较第10页/共47页n其他：其他：斑点印迹斑点印迹(dot blotting)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵点阵(DNA array)DNA芯片技术芯片技术(DN
4、A chip)12第11页/共47页13DNA芯片技术第12页/共47页第二节PCR技术的原理与应用第13页/共47页5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 模板模板DNA一、一、PCR技术的工作原理技术的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 15第14页/共47页Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含的含量可以扩大量可以扩大100万倍以上。万倍以上。16第15页/共47页17PCR技术原理示意图 第16页/共47页n PCR的基本反应步骤的基本反应步骤
5、变性变性9595 C C延伸延伸72C退火退火Tm-5C18第17页/共47页模板模板DNA特异性引物特异性引物耐热性耐热性DNA聚合酶（如聚合酶（如Taq DNA聚合酶）聚合酶）dNTPsMg2+n PCR体系基本组成成分体系基本组成成分19第18页/共47页利利用用特特异异性性引引物物以以cDNA或或基基因因组组DNA为为模模板板获获得得已已知知目目的的基基因因片片段段,或或与与逆逆转转录录反反应应相相结结合合，直接以组织和细胞的直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段；利利用用简简并并引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中获获得得序列相似的基因片
6、段；序列相似的基因片段；利利用用随随机机引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中克克隆隆基因。基因。二、二、PCR技术技术的主要用途的主要用途20（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆第19页/共47页利利用用PCR技技术术可可以以随随意意设设计计引引物物在在体体外外对对目目的的基基因因片片段段进进行行嵌嵌和和、缺缺失失、点点突变等改造。突变等改造。PCR技技术术高高度度敏敏感感，对对模模板板DNA的的量量要要求求很很低低，是是DNA和和RNA微微量量分分析析的最好方法。的最好方法。（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变21第
7、20页/共47页将将PCR技技术术引引入入DNA序序列列测测定定，使使测测序工作大为简化，也提高了测序的速度；序工作大为简化，也提高了测序的速度；待待测测DNA片片段段既既可可克克隆隆到到特特定定的的载载体体后进行序列测定，也可直接测定。后进行序列测定，也可直接测定。PCR与与其其他他技技术术的的结结合合可可以以大大大大提提高高基因突变检测的敏感性基因突变检测的敏感性。（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析22第21页/共47页n n逆转录逆转录逆转录逆转录PCR(reverse transcription PCRPCR(reverse transcriptio
8、n PCR，RT-RT-PCR)PCR)是将是将是将是将RNARNA的逆转录反应和的逆转录反应和的逆转录反应和的逆转录反应和PCRPCR反应联反应联反应联反应联合应用的一种技术。合应用的一种技术。合应用的一种技术。合应用的一种技术。n nRT-PCRRT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基是目前从组织或细胞中获得目的基是目前从组织或细胞中获得目的基是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的因以及对已知序列的因以及对已知序列的因以及对已知序列的RNARNA进行定性及半定量进行定性及半定量进行定性及半定量进行定性及半定量分析的最有效方法。分析的最有效方法。分析的最有效方法。分析的最有效方法
9、。（一）逆转录（一）逆转录PCR技术技术三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术23第22页/共47页n n原原原原位位位位PCRPCR是是是是在在在在组组组组织织织织切切切切片片片片或或或或细细细细胞胞胞胞涂涂涂涂片片片片上上上上的的的的单单单单个个个个细细细细胞胞胞胞内内内内进进进进行行行行的的的的PCRPCR反反反反应应应应，然然然然后后后后用用用用特特特特异异异异性性性性探探探探针针针针进进进进行行行行原原原原位位位位杂杂杂杂交交交交，即即即即可可可可检检检检出出出出待待待待测测测测DNADNA或或或或RNARNA是是是是否否否否在在在在该该该该组织或细胞中存在。组织或细胞中
10、存在。组织或细胞中存在。组织或细胞中存在。n n原原原原位位位位PCRPCR方方方方法法法法弥弥弥弥补补补补了了了了PCRPCR技技技技术术术术和和和和原原原原位位位位杂杂杂杂交交交交技技技技术术术术的的的的不不不不足足足足，是是是是将将将将目目目目的的的的基基基基因因因因的的的的扩扩扩扩增增增增与与与与定定定定位位位位相相相相结结结结合合合合的的的的一种最佳方法。一种最佳方法。一种最佳方法。一种最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技术技术24第23页/共47页（三）实时（三）实时PCR技术技术实实时时PCR(real-time PCR)技技术术通通过过动动态态监监测测反反应应过过程程中中的的
11、产产物物量量，消消除除了了产产物物堆堆积积对对定定量量分分析析的的干干扰扰，亦亦被被称称为为定定量量PCR。25第24页/共47页QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 335526n 实时实时PCR技术原理技术原理第25页/共47页27TaqMan探针法实时PCR原理示意图第26页/共47页第三节基因文库第27页/共47页基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)cDNA文库文库(cDNA library)n基因文库基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNA序序列的克隆群体。列
12、的克隆群体。29第28页/共47页一、基因组一、基因组DNA文库文库基因组基因组DNA文库是指生物的文库是指生物的基因组基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。片段形式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库的载体有 噬菌体、噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。粘粒和酵母人工染色体等。30第29页/共47页31基因组文库和cDNA文库的构建与筛选第30页/共47页第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第二轮筛选第三轮筛选第三轮筛选32n基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例第31页/共47页cDNA文库
13、是包含某一组织细胞在一定文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成经逆转录而合成的的cDNA序列序列的克隆群体，它以的克隆群体，它以cDNA片段的片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、二、cDNA文库文库33第32页/共47页第四节生物芯片技术第33页/共47页是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段有规律地紧密片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯
14、片进行扫描，通过计算机系统对每一位点等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵微阵列。列。一、基因芯片一、基因芯片35n基因芯片基因芯片(gene chip)第34页/共47页36双色荧光标记探针基因芯片工作流程示意图第35页/共47页是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，
15、再再经经检检测测系系统统对对靶靶蛋蛋白白进进行行定定性性和和定定量量分分析析的的一一种种技术。技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片n蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)n蛋白质芯片蛋白质芯片作用原理作用原理37蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应第36页/共47页第五节生物大分子相互作用研究技术第37页/共47页一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技
16、术常用蛋白质相互作用的研究技术39第38页/共47页标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。结合的未知分子。40第39页/共47页41标签融合蛋白沉淀实验流程示意图第40页/共47页（二）
17、酵母双杂交技术的基本原理（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途和用途42第41页/共47页n酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成基因融合成为为“诱饵诱饵”表达质粒，可以筛选表达质粒，可以筛选AD基因融合基因融合的的“猎物猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作
18、基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。用蛋白质。43第42页/共47页电电泳泳迁迁移移率率变变动动测测定定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或或称称凝凝胶胶迁迁移移变变动动实实验验(gel shift assay)最最初初用用于于研研究究DNA结结合合蛋蛋白白与与相相应应DNA序序列列间间的的相相互互作作用用，可可用用于于定定性性和和定定量量分分析析，已已经经成成为为转转录录因因子子研研究究的的经经典典方方法法。目目前前这这一一技技术术也也被被用用于于研研究究RNA结结合合蛋蛋白白和和特特定定RNA序序列列间间的相互作用。的相互作用。二、二
19、、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定44第43页/共47页放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10X45凝胶迁移率变动分析示意图第44页/共47页染染色色质质免免疫疫沉沉淀淀技技术术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是是目目前前可可以以研研究究体体内内DNA与与蛋蛋白白质质相相互互作作用的主要方法。用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀技术（二）染色质免疫沉淀技术46第45页/共47页47染色质免疫沉淀技术流程及结果示意图第46页/共47页48感谢您的观看。感谢您的观看。第47页/共47页