分子生物学常用技术.ppt

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1、分子生物分子生物学常用技学常用技术术 第十七章第十七章分子生物学常用技术分子生物学常用技术 凝胶电泳凝胶电泳 分子杂交分子杂交 聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)技术技术 DNA的物理图谱的物理图谱 DNA序列测定序列测定 基因芯片基因芯片第一节第一节 凝胶电泳凝胶电泳(gel electrophoresis)电泳概念电泳概念基本原理基本原理 Q 6r:迁移率迁移率 Q:电荷量电荷量 r:粒子半径（分子量）粒子半径（分子量）:介质粘度介质粘度 电泳的用途电泳的用途分离分离鉴定纯度鉴定纯度测定分子量测定分子量凝胶电泳的种类凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝

2、胶电泳 一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)分离核酸原理分离核酸原理 操作要点操作要点 应用范围应用范围（一）（一）分离核酸原理分离核酸原理 电荷效应电荷效应 分子筛效应分子筛效应 分子构象分子构象1.电荷效应电荷效应 核酸是核酸是两性电解质两性电解质 pH=3.5,正电荷正电荷 pH=8.08.3,负电荷，正极负电荷，正极2.分子筛效应分子筛效应 小分子小分子移动快移动快，大分子移动慢，大分子移动慢3.分子构象分子构象闭环超螺旋闭环超螺旋线状线状DNA开环开环DNA+-（二）操作要点（二）操作要点支持物支持物 凝胶浓度的选择凝胶浓度的

3、选择 DNA分子量标准分子量标准 电泳缓冲液电泳缓冲液 样品制备样品制备 电泳条件电泳条件 DNA电泳染色电泳染色 DNA片段的回收片段的回收 1.支持物支持物商品化的琼脂糖商品化的琼脂糖琼脂糖种类琼脂糖种类普通普通低熔点低熔点高纯高纯高筛分高筛分熔点熔点8090几十几十V/cm温度：温度：1525 潜水电泳潜水电泳7.电泳染色电泳染色 溴乙锭溴乙锭(ethidium bromide,EB)结构及染色原理结构及染色原理 染色方法染色方法加入凝胶液中加入凝胶液中 电泳结束后电泳结束后染色染色 EB染色原理染色原理紫外灯下显色紫外灯下显色8.DNA片段的回收片段的回收低熔点琼脂糖法低熔点琼脂糖法

4、透析袋电洗脱法透析袋电洗脱法(5kb)DEAE-纤维素膜法纤维素膜法(0.55kb)（三）应用范围（三）应用范围 DNA的分离、纯化和鉴定的分离、纯化和鉴定 限制性酶切图谱分析限制性酶切图谱分析 重组体的分离、鉴定重组体的分离、鉴定 杂交分析杂交分析 PCR产物的分离鉴定产物的分离鉴定 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分离原理分离原理 操作要点操作要点 优点优点 应用范围应用范围（一）分离原理（一）分离原理 电荷效应电荷效应 分子筛效应分子筛效应PAGE支持物支持物单体丙烯

5、酰胺单体丙烯酰胺(Acr)交联剂甲叉双丙烯酰胺交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)催化剂过硫酸胺催化剂过硫酸胺(AP)加加速速剂剂N,N,N,N-四四甲甲基基乙乙二二胺胺(TEMED)聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶（二）操作要点（二）操作要点凝胶的分类凝胶的分类 凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择 凝胶液的配制凝胶液的配制 凝胶中凝胶中DNA的检测的检测DNA片段的回收片段的回收 1.凝胶的分类凝胶的分类非变性非变性凝胶：凝胶：dsDNA变性凝胶变性凝胶:ssDNA尿素尿素甲酰胺甲酰胺SDS2.凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择3.凝胶液的配制凝胶液的配制 试剂(ml)制备浓度(%)3.5 5.08.012203

6、0%Acr11.6 16.6 26.640.066.6ddH2O67.7 62.7 52.739.312.75XTBE20.0 20.0 20.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100mlPAGE装置装置电电 泳泳4.凝胶中凝胶中DNA的检测的检测溴乙锭染色法溴乙锭染色法 银盐染色法银盐染色法 甲醛甲醛 还原还原放射自显影法放射自显影法 Ag+DNA Ag（黑褐色）黑褐色）5.DNA片段的回收片段的回收压碎浸泡法压碎浸泡法 1kb 纯度高，回收率低纯度高，回收率低（三）（三）PAGE优点优点机械强度好、化学稳定性高机械强度好、化学稳定性高分辨率高分辨

7、率高 载样量大载样量大 回收的回收的DNA纯度高纯度高 （四）（四）PAGE应用范围应用范围分离、纯化和鉴定分离、纯化和鉴定RNA和小分子和小分子DNA DNA序列分析序列分析 PCR产物鉴定产物鉴定 蛋白质的检测和分析蛋白质的检测和分析 第二节第二节 分子杂交分子杂交分子杂交的基本原理分子杂交的基本原理固相支持物固相支持物探针探针几种常用杂交技术几种常用杂交技术一、分子杂交的基本原理一、分子杂交的基本原理 核酸的变性和复性核酸的变性和复性分分子子杂杂交交DNA-DNADNA-RNA杂交条件杂交条件 靶分子靶分子 探针探针 杂交袋杂交袋 杂交炉杂交炉杂交种类杂交种类被检核酸种类和方法被检核酸种

8、类和方法 原位杂交原位杂交斑点杂交斑点杂交Southern杂交杂交Northern杂交杂交Western杂交杂交 反应介质反应介质 液相杂交液相杂交 固相杂交固相杂交()二、固相支持物二、固相支持物 固相支持物的特性固相支持物的特性结合能力强结合能力强不影响杂交反应不影响杂交反应结合牢固结合牢固 非特异性吸附少非特异性吸附少 机械性能良好机械性能良好 固相支持物的种类固相支持物的种类 硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter membrane)尼龙膜尼龙膜(nylon membrane)1.硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 特点特点吸附吸附ssDNA和和RNA 杂

9、交信号本底低杂交信号本底低 不足不足不适于重复杂交不适于重复杂交滤膜较脆滤膜较脆 不适于电转移印迹法不适于电转移印迹法 对对DNA小片段小片段(缺口翻译缺口翻译 操作简便操作简便 DNA/cDNA 探针探针 DNA的的5末端标记末端标记(5end labeling)碱性磷酸酶碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶 标记原理标记原理 制备寡核苷酸探针制备寡核苷酸探针 制备短的制备短的DNA/RNA探针探针 DNA的的5末端标记末端标记四、四、Southern 杂交杂交Southern blotting/DNA blotting1975年，年，Edwen Southern等等印迹印迹(blotti

10、ng):转移转移 blot:a spot or mark,esp.of ink blotting 1.印迹的方法印迹的方法 毛细管转移法毛细管转移法 电转移法电转移法 真空转移法真空转移法 毛细管转移法毛细管转移法 电转移法电转移法真空转移法真空转移法2.Southern 杂交的步骤杂交的步骤3.Southern 杂交的应用杂交的应用基因的定性及定量分析基因的定性及定量分析基因的酶切图谱分析基因的酶切图谱分析基因突变分析基因突变分析 RFLP五、五、Northern 杂交杂交 RNA blotting 步骤步骤 总总RNA/mRNA变性电泳分离变性电泳分离转移转移杂交杂交放射自显影放射自显影/

11、化学显色化学显色 应用应用检测组织检测组织/细胞中细胞中mRNA的大小的大小、量量 比较不同组织比较不同组织/细胞中基因的表达情况细胞中基因的表达情况 Northern 杂交杂交六、六、Western 杂交杂交免疫印迹免疫印迹(immunoblotting)SDS-PAGE转转移移蛋蛋白白第第一一抗抗体体标记的第二抗体标记的第二抗体(探针探针)检测检测 应用应用-蛋白质的定性定量分析蛋白质的定性定量分析免疫印迹免疫印迹 Southern,Northern&Western待测物质待测物质 支持物支持物 探针探针 转移方式转移方式Southern DNANC 单链核酸单链核酸 毛细管毛细管/电电/

12、真空真空 Northern RNANC/尼龙尼龙 单链核酸单链核酸 毛细管毛细管/电电/真空真空 Western 蛋白质蛋白质NC/PVDF 抗体抗体电电转移转移 七、原位杂交七、原位杂交(in situ hybridization)定义定义种类种类细胞内原位杂交细胞内原位杂交组织切片原位杂交组织切片原位杂交 基本程序基本程序 细胞细胞/组织固定组织固定预杂交预杂交杂交杂交冲洗冲洗 杂交信号检测杂交信号检测 分析结果分析结果 组织切片组织切片八、斑点杂交八、斑点杂交(dot hybridization)第三节第三节 PCR技术技术 聚合酶链反应聚合酶链反应 (polymerase chain

13、reaction,PCR)PCR的发展简史的发展简史PCR的基本原理和步骤的基本原理和步骤PCR的影响因素的影响因素PCR的种类的种类PCR的应用的应用一、一、PCR的发展简史的发展简史 1971年年,Korana提出核酸体外扩增提出核酸体外扩增的设想的设想 1985年年,Mullis 等发明了等发明了PCR技术技术 1988年年,PE-Cetus公司推出了第公司推出了第一台一台PCR仪仪 二、二、PCR的基本原理和步骤的基本原理和步骤基本原理基本原理DNA复制复制 三个步骤三个步骤变性变性(denaturation)退火退火(annealing)延伸延伸(extension)PCR的原理的原

14、理PCR的扩增产物的扩增产物cycle 12345n长片段长片段 246810短片段短片段 002822长短长短 21222324252n标准的标准的PCR反应体系反应体系 10X 扩增缓冲液：扩增缓冲液：10ul 模板模板DNA:0.12ug 引物：引物：各各0.21umol/L 4种种dNTP:各各200umol/L Mg2+:1.5mmol/L Taq DNA聚合酶：聚合酶：2.5U 总体积：总体积：100ul三、三、PCR的影响因素的影响因素 模板模板 引物引物 Taq DNA聚合酶聚合酶 4种种dNTP Mg2+循环条件循环条件 模板模板 DNA RNAcDNA 对模板的纯度对模板的

15、纯度要求低要求低引物引物长度：长度：1530nt G+C含量：含量：4060%碱基的随机分布碱基的随机分布 避免引物自身和引物之间的互补避免引物自身和引物之间的互补 引物的引物的3端端 引物的引物的5端端 引物浓度：引物浓度：0.21umol/L Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5U/100ul 20保存保存 最后加最后加 底物底物 4种种dNTP 的浓度相等的浓度相等终浓度：终浓度：200umol/L Mg2+浓度浓度:1.52.0mmol/L 过高过高:非特异扩增非特异扩增 过低过低:反应产物减少反应产物减少 循环条件循环条件变性温度和时间变性温度和时间:9096,3060s 退火温度和时

16、间退火温度和时间:4060,3060sTm=4(G+C)+2(A+T)延伸温度和时间延伸温度和时间7075(72)1kb,1min;34kb,34min;10kb,15min循环次数循环次数:2535 四、四、PCR的种类的种类反转录反转录PCR原位原位PCR(in situ PCR)实时实时PCR(real time PCR)重组重组PCR(recombinant PCR)锚定锚定PCR(anchored PCR)反向反向PCR(inverse PCR)原位原位PCR原位杂交原位杂交PCR程序程序 固定细胞固定细胞/组织样品组织样品PCR前处理前处理PCR扩增扩增原位杂交及原位杂交及检测检测

17、 实时实时PCR的原理的原理五、五、PCR的应用的应用分子生物学研究分子生物学研究临床医学临床医学分子生物学研究分子生物学研究基因克隆基因克隆 DNA序列测定序列测定基因的体外定点突变基因的体外定点突变 突变分析突变分析(PCR-SSCP)基因定量基因定量 临床医学临床医学病原体诊断病原体诊断 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断 肿瘤检测肿瘤检测 法医学法医学 第四节第四节 DNA序列测定序列测定 Sanger 双脱氧链终止法双脱氧链终止法(1977)Maxam-Gilbert化学裂解法化学裂解法(1977)Sanger 双脱氧链终止法双脱氧链终止法 原理原理DNA复制复制 反应条件反应条件 模

18、板模板引物引物 dNTP（其中一种带放射性标记）其中一种带放射性标记）ddNTP DNA聚合酶聚合酶DNA的复制的复制2,3-双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸(ddNTP)DNA测序操作测序操作DNA自动测序自动测序 DNA自动测序仪自动测序仪第六节第六节 生物芯片生物芯片(Biochip)20世纪世纪90年代年代末末生物分子之间相互作用的特异性生物分子之间相互作用的特异性种类种类 细胞芯片、组织芯片、微生物芯片、细胞芯片、组织芯片、微生物芯片、基因芯片基因芯片、蛋白质芯片、蛋白质芯片 基因芯片基因芯片 概念概念 种类种类 应用领域应用领域 表达谱基因芯片及其检测原理表达谱基因芯片及其检测原理 应用举

19、例应用举例什么是基因芯片？什么是基因芯片？基因芯片基因芯片(Gene chip,DNA chip),又称又称为为DNA微阵列微阵列(DNA Microarray)，是是指固定在载体上的高密度指固定在载体上的高密度DNA微点微点阵。具体地说就是将大量阵。具体地说就是将大量寡核苷酸寡核苷酸或或cDNA有序地、高密度地排列在玻有序地、高密度地排列在玻璃、硅等固相载体上。璃、硅等固相载体上。基因芯片基因芯片芯片的制备芯片的制备基因芯片的种类基因芯片的种类表达谱基因芯片表达谱基因芯片 诊断芯片诊断芯片 检测芯片检测芯片 基因芯片的应用领域基因芯片的应用领域基因芯片基因芯片基因表达谱疾病诊断药物筛选新基因寻找 测序基因分型基因突变表达谱基因芯片及其检测原理表达谱基因芯片及其检测原理研究在不同组织或细胞、不同发育研究在不同组织或细胞、不同发育阶段中基因的表达差异，进而阐明阶段中基因的表达差异，进而阐明基因的功能基因的功能 检测原理检测原理表达谱基因芯片表达谱基因芯片应用举例应用举例用基因表达谱芯片研究人正常和肝用基因表达谱芯片研究人正常和肝细胞癌中差异表达的基因细胞癌中差异表达的基因 肿瘤的分型及预测肿瘤的分型及预测 1999年，年，Gulop等等 急性白血病的分型急性白血病的分型 AML(13/10)ALL(25/24)