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1、云南省云南省肿瘤瘤肿瘤瘤医医院病理科院病理科 李李 磊磊浅谈冰冻切片的体会浅谈冰冻切片的体会影响术中病理诊断准确性的因素 低低低低温温温温对组织对组织的的的的损伤损伤,细细胞着色力及快速出片影胞着色力及快速出片影胞着色力及快速出片影胞着色力及快速出片影响响响响1 1 切片破碎、切片破碎、皱褶多、空洞、冰晶褶多、空洞、冰晶现象象2 2 切片厚薄不均、切片厚薄不均、切片厚薄不均、切片厚薄不均、细细胞重胞重胞重胞重叠叠叠叠、色、色、色、色调调不正不正不正不正3 3 颜颜色色色色对对比不比不比不比不协调协调、染色不均、模糊不、染色不均、模糊不、染色不均、模糊不、染色不均、模糊不清清清清4 4 病理申病
2、理申病理申病理申请单书请单书写写写写不不不不规规范、送范、送范、送范、送检检不及不及不及不及时时等等等等5 5取材取材取材取材速速速速冻冻如何提高冰冻切片的质量 技术员技术员温温温温度度度度切片切片切片切片固定固定固定固定染色染色染色染色包埋包埋相互沟通理解取材取材医医生生临床床医医生生技技术员诊断医断医生生取材取材取材取材送检组织宜新鲜、及时并避免遇水取材器械保持干燥、清洁组织本身含水较多则可用滤纸吸干避免不必要的脂肪附着通过申请单的病史及所取组织有初步认知程度小结：以上诸多要求，其实我们最主要的目的就是从根源上控制冰晶的产生，因为冰晶会导致细胞间针状裂隙，细胞结构改变，细胞核普遍增大，影响
3、诊断准确性。冰冻组织的包埋包埋组织时应将组织周边多留出 O.C.T.用于牵引展开切片之用,否则出刀、入刀处会有皱褶影响制片效果。O.C.T.中的小气泡应尽量去除,以免影响旁边组织产生挤压和皱褶。较小的组织在包埋时可以先制作一个 O.C.T.冻托,待冻托基本凝固时,将组织放在冻托上,再在周围放上 O.C.T.后速冻。囊壁类组织需要立埋时,可将几条囊壁紧靠一起卷成 U字形,可以帮助囊壁更好保持侧立。OCT的放置不宜过多，太多了影响速冻时间产生冰晶。包埋包埋速速速速冻冻为什么速冻呢？如何才能保证速冻？尽量减少冰晶的产生当然是为了减少冰产生冻锤的使用冻锤的使用半导体制冷半导体制冷液氮液氮冻锤的使用 在
4、组织冷冻过程中,组织内可产生大量的冰晶影响冰冻切片的诊断,为了防止组织内冰晶的产生最好的办法是使用冻锤。新鲜标本包埋后放入冷冻台时,不能将冻锤马上按压在组织上,那样会使组织 受挤压变形。应该待 O.C.T.60%70%凝固时 再将冻锤轻压在组织上,这样既能防止冰晶的产生 又能得到较平整的切面。温温温温度度度度温度过低组织过硬温度过高硬度不够小结：技术员切片温度组织硬度控制最佳温度是获得既薄又完整切片的基础控制最佳温度是获得既薄又完整切片的基础1温度过低组织过硬导致切片破碎温度过低组织过硬导致切片破碎2温度过高硬度不够无法切片温度过高硬度不够无法切片3切片切片切片切片组织冻结后将组织连同样本托固
5、定到冷冻头上,设定切片厚度 4um。用样品快进按钮 将样品移近刀口,调整要切的平面,利用慢进按钮 先粗切修出组织最完整切面后细切 1 2张弃用,继续细切时左手持毛笔轻拉 O.C.T.边缘,右手切片,双手匀速配合。待组织切片完整拉下铺于组织样品上,（也可以使用废片轻轻拖至切片刀刃上，右手半切组织过程中，顺势将废弃组织与待切组织片粘连，轻轻向后拉动，当组织切到位点以后，就形成一张完整的切片）再用常温载玻 片粘贴后迅速放入乙醚酒精混合固定液中中固定2分钟左右。切片注意事项1、样本托放入机头时，必须根据组织的结构及走势来放置。2、较硬的组织切片时，组织表面呈胶冻状时，将其修切去，因为冷冻是自下而上，表
6、面呈胶冻状时(例如内膜癌的子宫肌壁带全层)，下面组织已符合切片最佳时机。3、组织过冻时，可带上薄膜手套用拇指置于组织块表面几秒钟。4、组织有部分不需要或阻碍我们获得高质量切片时，可将其挖除。5、切片时，注意观察组织表面有无包膜，结节，但修片时也必须注意观察重点病变的微小病灶避免修切过度，造成误诊，漏诊，切片厚度45um，淋巴结切片 3 um 为宜。OCT疑似病变组织诊断医生所取材组织冷冻常见问题及对策1、取材常见问题及对策 1.1取材常见问题及对策 组织被挤压:取材刀剪必须锋利，切割时不可来回锉动 夹取组织时切勿猛压，以免挤压损伤组织。1.2组织块过大:冷冻时间延长易产生冰晶，在不影响病理诊断
7、的前提下，标本取材尽量小一些 切片后用载玻片贴片时手不能颤抖,而且在贴附组织时手要有一个向下伸展的动作,切片机的盖打开越小越好。2.组织贴附不平或有皱褶:常见于组织结构软硬不同的组织,解决方法:标本较硬的部分摆在上端,先切较软的部分,依次切到硬的部分,同时用毛笔轻轻地展开,或用抗卷板才能切出完整的切片。3.组织挤压、皱缩:4.组织破碎 组织破碎:如果组织冰冻过头,使之发脆就会发生破碎,这时用手贴在组织上片刻稍加温使其软化即可切出完整的切片。5脱片 冰冻切片一般很少脱片,偶尔见于坏死组织或纤维较多的组织，或者载玻片不清洁 切片太厚或组织本身的原因。解决方法:将组织切片切得更薄2-3um,切片固定
8、后用吹风机吹干或用防脱片贴片后染色，染色时轻拿轻放，防止人为脱片。6冷冻欠佳致切片困难:不易成形，产生搓板状，厚薄不均 破碎或糊糊状:组织冷冻时间不够或冷冻机内设定的温度未达到要求 可延长冷冻时间或调低冷冻机冷冻温度 若为刀片的温度不够冷，要预冷刀片。7、切片出现冰晶 主要是冷冻速度不够快捷，组织取材太厚、切片时组织温度太低、动作力度过大等因素造成。因此组织取材要适中为避免组织脱落，取好的组织底部及周围要及时入放适量的 OCT,然后迅速放入冷冻机内,不宜过多,否则会影响速冻时间而产生冰晶染色常见问题及对策 细胞核不清晰，核浆染色对比度不好 应选择合适的苏木精和伊红配方，为了加快染色时间，苏木精
9、提前配制成熟后再加温使用，成熟苏木精加温后染色时间1 2 min即可，由于苏木精加温后容易被破坏，应及时更换，苏木精染色后应显微镜下观察，确认细胞核染色清晰方可进行下一步 染伊红前切片一定要用流水冲洗干净，否则，伊红难着色或着色不均匀。固定固定固定固定 冰冻切片在病理快速诊断中运用广泛，但要做好一张优良的冰冻切片并非容易，尤其是冰冻组织固定不良会造成切片背景不清，染色不良等问题。所以一种合适的固定液是冰冻切片的必备条件。我院病理科产用乙醚酒精冰醋酸苦味酸混合固定液。染色染色染色染色选用新鲜配置的改良选用新鲜配置的改良Harris苏木素苏木素1苏木素加温，染色力强，但加速其氧化，需经常更换苏木素
10、加温，染色力强，但加速其氧化，需经常更换2蓝化时选用温水，建议不使用稀氨水蓝化时选用温水，建议不使用稀氨水3为了提高染片效率，染色所用各梯度酒精、二甲苯需按时更换为了提高染片效率，染色所用各梯度酒精、二甲苯需按时更换4染色固定苏木素盐酸酒精蓝化70%AL伊红95%AL80%AL无水酒精1无水酒精2无水酒精4无水酒精3二甲苯1二甲苯2封片冰晶会导致细胞间针状裂隙，细胞结构改变，细胞核普遍增大，影响诊断准确性。组织过冻以后照成的组织破碎，影响诊断准确性请大家看一下这张切片是什么原因照成的？回答对了有香吻哦！亲小结总之制作一张优良的冰冻切片，诊断医生和技术员都需要高度的责任心及相互之间的沟通与合作，尤其是技术员在日常工作中不断的摸索、学习和提高，练就一身过硬的技术，尽可能一次把切片做好，更好的为临床服务，减少病人的痛苦。讨论1、冰冻固定液固定标本时间的长短对组织切片的影响有没有?如果有，到底影响了哪些方面？除了适当的固定时间有无其它办法？2、手术过程中，局部麻醉液（利多卡因）是否会影响冰冻切片的制作，如果有，有何办法可以应对？3、组织本身的原因照成的切片模糊不清该怎么办？例如术前的放化疗对组织的影响，或者大面积的坏死，其周围的细胞结构影响所致的问题？