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1、土壤中分解尿素的细菌的分离和计数上课用一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之之后才能被植物利用。后才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶脲酶CO(NHCO(NH2 2)2 2脲酶脲酶+CO+CO2 2NHNH3 3+H2O3 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽孢杆
2、菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。也能分解尿素。4 4、课题目的、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照 1 1、实例：、实例：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。问：问：如果请你寻找这种耐高温的酶，你会去如
3、果请你寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找？哪里寻找？DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应（PCRPCR）是一种在体外是一种在体外将将少量少量DNADNA大量复制大量复制的技术，此项技术要求使的技术，此项技术要求使用用耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶（93930 0C C）。.筛选菌株筛选菌株问：问：为什么为什么TaqTaq细菌能从热泉中被筛选出来？细菌能从热泉中被筛选出来？水生耐热细菌水生耐热细菌TaqTaq：美国科学家布鲁克于美国科学家布鲁克于19661966年在美国黄石国家公园的一个热泉中发现，并分年在美国黄石国家公园的一个热泉中发现，并分离出耐高温的离出耐高温的TaqDNAT
4、aqDNA聚合酶。聚合酶。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，高温高温淘汰淘汰了绝大多数微生物（了绝大多数微生物（不耐热不耐热），只有），只有TaqTaq细菌细菌被筛选出来。被筛选出来。【研究思路】【研究思路】（一）筛选菌株（一）筛选菌株原理：原理：人为提供有人为提供有利于目的菌株利于目的菌株生长的生长的条件（包括营养、温度、条件（包括营养、温度、PHPH等），等），同时同时抑制或阻止抑制或阻止其他微生物生长。其他微生物生长。有选择作用 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基
5、包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基方法：方法：抑制大多数微生物生长抑制大多数微生物生长 造成有利于该菌生长的环境，造成有利于该菌生长的环境，结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO
6、4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属属于哪类培养基？于哪类培养基？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素选择培养基选择培养基 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能只有能合成脲酶合成脲酶的微生的微生物才能利用尿素作为氮源而生存物才能利用尿素作为氮源而生存。缺
7、乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4 4、该培养基如何将分解尿素的细菌选择出来？、该培养基如何将分解尿素的细菌选择出来？选择培养基：选择培养基：在微生物学中，将允许特定在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。微生物生长的培养基。分离尿素细菌分离尿素细菌用以判断选择性培养用以判断选择性培养基是否具有选择性基是否具有选
8、择性对设计实验的训练对设计实验的训练 对照组对照组牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 实验组实验组以尿素为氮源的培养基以尿素为氮源的培养基【统计菌落数目】【统计菌落数目】常用方法：常用方法：稀释涂布平板法稀释涂布平板法、显微镜、显微镜直接计数法，直接计数法，还可以用过滤膜法还可以用过滤膜法1 1、稀释涂布平板法、稀释涂布平板法（也叫活菌计数法）（也叫活菌计数法）（1 1）原理原理：当样品的稀释度足够高时，：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样
9、品中大约含有多少菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。活菌。1 1个菌落个菌落=1=1个活菌个活菌 稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。（2 2）操作方法：稀释涂布平板）操作方法：稀释涂布平板 统计菌落数。统计菌落数。（3 3）统计原则）统计原则 、选、选 30 30300 300 个菌落的平板统计。个菌落的平板统计。、每个稀释度取、每个稀释度取3 3个平板取其平均值个平板取其平均值。（4 4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目目低低，因此统计结果一般用，因此统计结果一般用菌落数菌落数来来表示。表示。没有设置重复组，因此结果没有设置重复组，因此结
10、果不具说服力。不具说服力。1 1个平板的计数结果与另个平板的计数结果与另2 2个个相差太远，说明在操作过程相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误。中可能出现了错误。不能简单地将不能简单地将3 3个平板的计数值用来求平均值。个平板的计数值用来求平均值。在设计实验时，一定要涂布至少在设计实验时，一定要涂布至少3 3个平板，作为重复组，才能个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。
11、需要重新实验。统计菌落数目统计菌落数目 P22注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在落数
12、在5050个左右为最好。个左右为最好。（三）设置对照（三）设置对照 在做本课题的实验时，在做本课题的实验时，A A 同学从对应同学从对应10106 6倍稀释的培养基中筛选倍稀释的培养基中筛选出大约出大约150150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出大约个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出大约5050个菌落。个菌落。其他同学认为其他同学认为A A同学的结果有问题。他们分析可能是同学的结果有问题。他们分析可能是A A同学的培同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养
13、基上生长。不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。但是，但是，A A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A A同学在同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出令人信服的设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出令人信服的证据。证据。你能通过设置对照，帮助你能通过设置对照，帮助A A同学学排除上述两个可能影响实验结同学学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？果的因素吗？设置对照的主要目的设置对照的主要目的是排除实验组
14、中非测试是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。.设置对照：设置对照：设置对照的方法：设置对照的方法：空白对照：不给对照组任何处理因素。空白对照：不给对照组任何处理因素。条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的 处理因素。处理因素。自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。A A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有
15、两种。同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误二是由于培养基污染或操作失误。小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结
16、果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火
17、焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的平板数的平板 三三 样品的稀释样品的稀释（二）土壤稀释（二）土壤稀释二、实验设计二、实验设计10101 110102 210103 310104 410105 510106 610107 710g土壤土壤9ml无菌水无菌水 9ml 无菌水无
18、菌水1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml10104 410104 410104 410105 510105 510105 510106 610106 610106 610107 710107 710107 7稀释涂布平板法稀释涂布平板法.取样涂布取样涂布如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030030300的平的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确试验不精确，需要重新实验。，需
19、要重新实验。.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察三三.结果分析与评价结果分析与评价
20、1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030030300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。大小、形状大小、形状大小、形状大小、形状（圆
21、形，假根状，不规则状）（圆形，假根状，不规则状）表面特征表面特征表面特征表面特征（光滑，皱缩，颗粒状，龟裂状，同心圆状）（光滑，皱缩，颗粒状，龟裂状，同心圆状）隆起形状隆起形状隆起形状隆起形状（扩展，台状，凹面，凸面，乳头状）（扩展，台状，凹面，凸面，乳头状）边缘情况边缘情况边缘情况边缘情况（整齐，波状，裂叶状，锯齿状）（整齐，波状，裂叶状，锯齿状）表面光泽表面光泽表面光泽表面光泽（无光泽，金属光泽，闪光）（无光泽，金属光泽，闪光）质地质地质地质地（油脂状，膜状，粘脆）（油脂状，膜状，粘脆）颜色、透明度颜色、透明度颜色、透明度颜色、透明度四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好
22、标记 规划时间规划时间 五五.课外延伸课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红伊红伊红伊红美蓝美蓝美蓝美
23、蓝 培养基上培养，大肠杆菌培养基上培养，大肠杆菌培养基上培养，大肠杆菌培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现深紫色，并且有菌落呈现深紫色，并且有菌落呈现深紫色，并且有菌落呈现深紫色，并且有金属光泽金属光泽金属光泽金属光泽，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在大肠杆菌在伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结:六、例题解析六、例题解析 例例1 1对细菌群体生长规律测定
24、的正确的表述是对细菌群体生长规律测定的正确的表述是 A A在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B B至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C C接种一个细菌接种一个细菌 DD及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体解析：细菌群体生长规律的测定生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物
25、的生长；定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。答案：答案：A A例例2 2在微生物群体生长规律的测定中，种内在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是斗争最显著最激烈的时期是A A调整期调整期 B B对数期对数期 C C稳定期稳
26、定期 D D衰亡期衰亡期解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在由此可知
27、，在稳定期稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，目已经开始减少，pHpH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。境的斗争。答案：答案：C C1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B.B.至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质及时
28、补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练A A C CD D4.4.下列说法不正确的是（下列说法不正确
29、的是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最
30、大，种类最多。种类最多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）入（）A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C例例3 3（20052005年江苏）抗生素作为治疗细菌感年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。义。青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢
31、类型青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是是 ，青霉素是青霉菌的，青霉素是青霉菌的 代谢产物。代谢产物。在生产和科研中，常选用处于在生产和科研中，常选用处于 期的青霉菌作期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，和和 比较稳定。比较稳定。对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，酵液，经离心分离、反复洗涤后，再计算发酵罐中菌体的总重量。，再计算发酵罐中菌体的总重量。异养需氧型异养需氧型次级次级对数对数个体的形态个体的形态生理特性生理特性称菌体的湿重称菌体的湿重（称烘干后的重量）（称烘干后的重量）谢谢观赏！2020/11/538