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1、课题课题2 2 土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离分离与与计数计数尿素尿素CO(NHCO(NH2 2) )2 2 重要的农业氮肥。重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为只能被土壤中细菌分解为NHNH3 3才能被植物吸才能被植物吸收利用收利用 CO(NH CO(NH2 2) )2 2 + H + H2 2O O COCO2 2 +2NH+2NH3 3细菌脲酶细菌脲酶一、课题背景一、课题背景（一）筛选菌株（一）筛选菌株KHKH2 2POPO4 4 1.4g 1.4g NaHPO NaHPO4 4 2.1g 2.1g MgSO MgSO4 4 H H2 2O 0.2gO 0.2g 葡萄
2、糖葡萄糖 10.0g10.0g 尿素尿素 1.0g1.0g 琼脂琼脂 15.0g15.0g 将上述物质溶解后，将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到用蒸馏水定容到1000mL1000mL。 该培养基的配方中，为该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？源的分别是什么物质？ 此配方能否筛选出产生此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？脲酶的细菌？为什么？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素氮源：尿素能。只有产生脲酶的能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮细菌能利用尿素作为氮源而生存。源而生存。（一）筛选菌株（一）筛选菌株1 1、选择培养基：、选择
3、培养基： 允许特定种类的微生物生长，同时允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。基。2 2、菌株：、菌株： 纯且活状态所保存的菌种纯且活状态所保存的菌种 。（二）统计菌落数目：（二）统计菌落数目： 1 1、活体计数法（、活体计数法（稀释涂布平板稀释涂布平板） （1 1）操作方法：）操作方法： 稀释涂布平板稀释涂布平板统计菌落数统计菌落数 （2 2）原理：）原理： 1 1个菌落个菌落1 1个活菌个活菌 （3 3）统计原则）统计原则 选选 3030 300 300 个菌落的平板统计个菌落的平板统计 每个稀释度取每个稀释度取3 3个平板取
4、其平均值个平板取其平均值 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，得到以下两种统计结果。的培养基中，得到以下两种统计结果。 1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为菌落数为230230。 2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂布了A A、B B、C C三个平板，三个平板，统计的菌落数分别为统计的菌落数分别为2121、212212、256256，该同学以这三，该同学以这三个平板上菌落数的平均值个平板上
5、菌落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？错在哪？ 甲：没有甲：没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板）个平板） 乙：乙：A A组结果误差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目 1 1、活菌计数法、活菌计数法 （4 4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目际数目低低，因此统计结果一般用菌落数表示。，因此统计结果一般用菌落数表示。 每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数= =（C/
6、V)C/V)* * M M C: C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V: V:所用稀释液的体积；所用稀释液的体积；M:M:稀释倍数。稀释倍数。2 2、显微镜直接计数、显微镜直接计数 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为过程中，从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，的培养基中，A A、B B两同学分别得到以下两种统计结果。两同学分别得到以下两种统计结果。 1 1、A A同学筛选出同学筛选出150150个菌落。个菌落。 2 2、B B同学筛选出同学筛选出5050个菌落。个菌落。 B B认为认为A
7、 A的培养基被杂菌污染了，或培养基的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。素的细菌也能在该培养基中生长。A A确认自己确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助请你帮助A A同学改进实验，提供具有说明同学改进实验，提供具有说明了的证据。了的证据。 设置对照设置对照同等条件下，培养空白培养基同等条件下，培养空白培养基（三）设置对照（三）设置对照 1 1、设置对照的目的：、设置对照的目的： 排除实验组中排除实验组中非测试因素非测试因素对实验结对
8、实验结果的影响，提高实验结果的可信度。果的影响，提高实验结果的可信度。 对照实验对照实验是指除了是指除了 被测试被测试 的条件外，的条件外，其他条件都其他条件都 相同相同 的实验。满足该条件的实验。满足该条件的称为的称为 对照对照组，未满足该条件的称为组，未满足该条件的称为 实验实验 组。组。四、实验过程四、实验过程 （一）土壤取样（一）土壤取样 （1 1）取样的位置：）取样的位置： 土壤，天然培养基，含有大量的微生物，土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中其中7070 9090是细菌。在富含有机质的土壤是细菌。在富含有机质的土壤层的层的3 3 8cm8cm处中分布着绝大多数的细菌。处中分布
9、着绝大多数的细菌。 （2 2）取样要求：铲去表层土。）取样要求：铲去表层土。 菌落计数菌落计数配制土壤配制土壤溶液溶液系列稀释系列稀释涂布平板与涂布平板与培养培养（二）样品稀释（二）样品稀释 （1 1）测细菌数：一般用）测细菌数：一般用10104 4、10105 5、10106 6稀释液稀释液 （2 2）测放线菌：一般用）测放线菌：一般用10103 3、10104 4、10105 5稀释液稀释液 （3 3）测真菌数：一般用）测真菌数：一般用10102 2、10103 3、10104 4稀释液稀释液原则：确保平板上的菌落数在原则：确保平板上的菌落数在3030 300300之间。之间。（三）微生物
10、的培养与观察（三）微生物的培养与观察 1 1、接种：用适当的稀释液作涂布平板、接种：用适当的稀释液作涂布平板 2 2、培养：细菌：、培养：细菌：3030 3737，1 1 2d;2d; 放线菌放线菌:25:25 28, 528, 5 7d;7d; 霉菌霉菌: 25: 25 28, 328, 3 4d.4d. 3 3、观察：、观察：a.a.每每24h24h统计一次菌落数目统计一次菌落数目 b.b.以以“稳定菌落稳定菌落”为观察对象为观察对象 (1)对样品进行系列稀释对样品进行系列稀释 (2)用适当的稀释液涂布平板用适当的稀释液涂布平板 在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。特征。（四）鉴定：筛选后必鉴定（四）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物鉴别培养基：不影响微生物的生存的生存 酚红培养基：酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解原理：脲酶催化尿素分解成氨成氨培养基碱性增强培养基碱性增强 酚酚红变红红变红脲酶阳性脲酶阳性