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1、会计学1生化检验生化检验(jinyn)技术基础技术基础第一页，共96页。一、比色分析一、比色分析(fnx)1 1 1 1比色分析理论比色分析理论比色分析理论比色分析理论Beer-Lambert Beer-Lambert Beer-Lambert Beer-Lambert 定律定律定律定律(dngl)(dngl)(dngl)(dngl)A=lg A=lg A=lg A=lg（I0/II0/II0/II0/I）KCL KCL KCL KCL 或或或或 I I I II010-KCLI010-KCLI010-KCLI010-KCL I0 I0 I0 I0：入射光强度：入射光强度：入射光强度：入射光强
2、度 I I I I：透过光强度：透过光强度：透过光强度：透过光强度 K K K K：常数：常数：常数：常数 C C C C：溶液浓度：溶液浓度：溶液浓度：溶液浓度 L L L L：溶液的厚度：溶液的厚度：溶液的厚度：溶液的厚度第1页/共96页第二页，共96页。（1 1）郎伯定律）郎伯定律 I0 I0 It It l l L L -dIIdl -dIIdl，-dI -dIaIdlaIdl，dI/I=-adldI/I=-adl 积分积分(jfn)It (jfn)It L L dI/I dI/I -a dl -a dl 得：得：ln(I0/It)ln(I0/It)-aL-aL I0 I0 0 0 将
3、将ln ln改为改为lg lg，则为：，则为：lg lg（I0/It I0/It）-0.434aL-0.434aLKLKL 令令lg lg（I0/It I0/It）A A，则，则A A KLKL第2页/共96页第三页，共96页。（2 2 2 2）比尔定律）比尔定律）比尔定律）比尔定律(dngl)(dngl)(dngl)(dngl)A A A AK”CK”CK”CK”C（3 3 3 3）郎伯）郎伯）郎伯）郎伯-比尔定律比尔定律比尔定律比尔定律(dngl)(dngl)(dngl)(dngl)A A A AKLCKLCKLCKLC第3页/共96页第四页，共96页。透光率（透光率（transmitta
4、ncetransmittance，T T，透射率）透射率）T TI/I0I/I0吸光度（吸光度（absorbanceabsorbance，A A）光密度（光密度（eptical densityeptical density，D D或或ODOD）A Alg I0/Ilg I0/I-lgT-lgT T T10-A10-A10-KCL10-KCL A AKCLKCL当当L L用用cmcm，C C用用mol/Lmol/L表示表示(biosh)(biosh)，则，则K K即称之为摩尔即称之为摩尔吸光系数，用吸光系数，用表示表示(biosh)(biosh)。当当C C1mol/L1mol/L，L L1cm
5、1cm，则，则A A。第4页/共96页第五页，共96页。T T与与A A的关系的关系(gun x)(gun x)透光率（透光率（T T）吸光度（吸光度（A A）1 1 0.0000.000 0.75 0.75 0.1250.125 0.5 0.5 0.3010.301 0.25 0.25 0.6020.602 0.17 0.17 0.7700.770 0.1 0.1 1.0001.000 0.05 0.05 1.3011.301 0.01 0.01 2.0002.000 0.001 0.001 3.0003.000第5页/共96页第六页，共96页。2 2影响因素影响因素(yn s)(yn s)
6、（1 1）化学因素）化学因素(yn s)(yn s)的影响的影响 溶溶液液中中溶溶质质可可因因浓浓度度的的改改变变而而发发生生离离解解、缔缔合合，与与溶溶剂剂间间的的作作用用等等原原因因而而出出现现偏偏离离比比尔尔定定律律的的现现象象。由由化化学学因因素素(yn(yn s)s)引引起起的的偏偏离离，有有时时可可控控制制溶溶液液条条件件设设法法减减免免。此此外外，能能产产生生荧荧光光的的物物质质也也可可导导致致偏偏离比尔定律。离比尔定律。第6页/共96页第七页，共96页。（2 2）非单色光的影响）非单色光的影响 比比尔尔定定律律的的一一个个重重要要条条件件是是单单色色光光，但但在在比比色色分分析
7、析(fnx)(fnx)中中常常有有不不同同波波长长的的光光同同时时存存在在。这这就就使使吸吸光光度度发发生生改变，从而偏离比尔定律。改变，从而偏离比尔定律。第7页/共96页第八页，共96页。波长波长(bchng)的选择的选择可见(kjin)绿色带黄深黄桔红深红深紫青紫紫蓝蓝色带绿绿色带蓝深绿Ultra-violet紫外200400深紫深红桔红深黄绿色带黄暗绿绿色带蓝蓝色带绿紫蓝青紫被测溶液颜色颜色750800610750595610560580580595500560490500480490435480400435波长(nm)第8页/共96页第九页，共96页。（3 3）光学因素的影响）光学因素
8、的影响 散散射射是是向向空空间间各各个个方方向向，而而使使透透射射光光减减弱弱。反反射射可可使使光光能能损损失失，当当光光线线通通过过两两种种不不同同(b(b tn)tn)介介质质时时，则则发发生生反反射射。当当样样本本溶溶液液与与空空白白溶溶液液的的折折射射率率有有较较大大差差异异时时，导导致致吸吸收值的偏差。收值的偏差。（4 4）非非平平行行光光通通过过吸吸收收池池时时，由由于于光光线线的的倾倾斜斜使使厚厚度度L L增增大大而影响测量值。而影响测量值。第9页/共96页第十页，共96页。3 3比色法的误差比色法的误差(wch)(wch)（1 1 1 1）仪器误差）仪器误差）仪器误差）仪器误差
9、 滤滤滤滤光光光光片片片片，狭狭狭狭缝缝缝缝过过过过宽宽宽宽，光光光光电电电电池池池池疲疲疲疲劳劳劳劳，仪器结构仪器结构仪器结构仪器结构(jigu)(jigu)(jigu)(jigu)，散热不良。，散热不良。，散热不良。，散热不良。（2 2 2 2）方法误差）方法误差）方法误差）方法误差 （3 3 3 3）操作误差）操作误差）操作误差）操作误差第10页/共96页第十一页，共96页。比色法举例比色法举例(j l)1.1.总蛋白总蛋白(TP)(TP)蛋白质中的肽键蛋白质中的肽键+Cu 2+Cu 2+碱性条件碱性条件 紫红色络合物紫红色络合物引起在波长引起在波长540560nm540560nm范围内
10、吸光度范围内吸光度的上升的上升(shngshng),(shngshng),与总蛋白与总蛋白含量成正比含量成正比2.2.白蛋白白蛋白(ALB)(ALB)白蛋白白蛋白+溴甲酚绿溴甲酚绿 pH4.2 pH4.2 白蛋白白蛋白溴甲酚绿复合物溴甲酚绿复合物引起在波长引起在波长630nm630nm范围内吸光度的上范围内吸光度的上升升(shngshng),(shngshng),与白蛋白含量与白蛋白含量成正比成正比第11页/共96页第十二页，共96页。二、分光二、分光(fn un)光度计光度计1 1 1 1光源光源光源光源(gungyun)(gungyun)(gungyun)(gungyun)热光源热光源热光
11、源热光源(gungyun):(gungyun):(gungyun):(gungyun):钨灯、卤钨灯（钨灯、卤钨灯（钨灯、卤钨灯（钨灯、卤钨灯（3203203203202500nm2500nm2500nm2500nm）气体放电光源气体放电光源气体放电光源气体放电光源(gungyun)(gungyun)(gungyun)(gungyun)：氢灯、氘灯（氢灯、氘灯（氢灯、氘灯（氢灯、氘灯（185185185185375nm375nm375nm375nm）。）。）。）。氘氘氘氘灯灯灯灯发发发发光光光光强强强强度度度度比比比比氢氢氢氢灯灯灯灯强强强强3 3 3 35 5 5 5倍倍倍倍，是是是是 目目
12、目目 前前前前 紫紫紫紫 外外外外 光光光光 区区区区 常常常常 用用用用 光光光光 源源源源(gungyun)(gungyun)(gungyun)(gungyun)。第12页/共96页第十三页，共96页。2.2.单色器单色器 单单色色器器是是一一种种用用来来把把光光源源发发出出的的复复合合光光分分解解成成单单色色光光，并并能能任任意意改改变所需波长的装置。变所需波长的装置。(1)(1)棱镜棱镜 玻玻璃璃棱棱镜镜的的折折射射率率大大、色色散散能能力力也也大大，因因而而分分辨辨本本领领高高。但但它它吸吸收收紫紫 外外 光光，因因 此此 只只 适适 用用 于于 3503503000nm3000nm
13、的波长范围。的波长范围。石石英英棱棱镜镜对对紫紫外外光光吸吸收收少少，适适用用于于195-4000nm195-4000nm间间分分光光(fn(fn un)un)。但但由由于于石石英英棱棱镜镜折折射射率率低低于于玻玻璃璃，因因而色散能力差。而色散能力差。第13页/共96页第十四页，共96页。(2)(2)光栅光栅 光光栅栅是是利利用用光光的的衍衍射射、干干涉涉原原理理制制成成的的色色散散元元件件。目目前前，全全息息光光栅栅在在质质量量上上，成成本本上上都都大大大大(d(d d)d)优优于于机机械械光光栅栅。因因光光栅栅分分光光在在紫紫外外和和可可见见光光区区均均适适用用，且且色色散散力力强强、分分
14、辨辨率率高高，故故近近年年生生产产的的分分光光光光度度计计大大都都采采用用光光栅栅作作单单色色器。器。第14页/共96页第十五页，共96页。3 3比色杯比色杯 比比色色杯杯可可由由玻玻璃璃和和石石英英等等材材料料(cilio)(cilio)制制成成，玻玻璃璃适适用用于于350nm350nm以以上上光光区区，而而石石英英杯杯则则适适用用于于紫紫外外和可见光区。和可见光区。第15页/共96页第十六页，共96页。4 4检测器检测器 在在分分光光光光度度计计中中，把把光光信信号号(xnho)(xnho)转转变变成成电电信信号号(xnho)(xnho)输出的装置称检测器。输出的装置称检测器。光电池光电池
15、 光电管光电管 光电倍增管光电倍增管 第16页/共96页第十七页，共96页。双波长分光光度计双波长分光光度计 来自光源的光被两个单色器分别分来自光源的光被两个单色器分别分离出波长为离出波长为11和和22的两束单色光。经的两束单色光。经过折波器后，两束波长不同的单色光过折波器后，两束波长不同的单色光交替地照射于同一样品杯。样品杯背交替地照射于同一样品杯。样品杯背后后(bihu)(bihu)的光电倍增管交替地接的光电倍增管交替地接收到两种波长照射吸收池后所产生的收到两种波长照射吸收池后所产生的信号。此信号经电子电路转化为两个信号。此信号经电子电路转化为两个吸光度之差吸光度之差A A。第17页/共9
16、6页第十八页，共96页。三、酶法分析三、酶法分析(fnx)酶法分析包括两方面的内容：酶法分析包括两方面的内容：酶法分析包括两方面的内容：酶法分析包括两方面的内容：借借借借助助助助酶酶酶酶来来来来测测测测定定定定某某某某一一一一化化化化合合合合物物物物的的的的浓浓浓浓度度度度，如如如如测测测测定定定定体体体体液液液液(t(t y)y)中中中中的的的的葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖、甘甘甘甘油油油油三三三三酯、胆固醇、尿素、尿酸、肌酐等。酯、胆固醇、尿素、尿酸、肌酐等。酯、胆固醇、尿素、尿酸、肌酐等。酯、胆固醇、尿素、尿酸、肌酐等。借借借借助助助助酶酶酶酶来来来来测测测测定定定定另另另另一一一一种种种种
17、酶酶酶酶的的的的活活活活性性性性，实实实实际际际际上上上上是是是是用用用用酶酶酶酶来来来来测测测测定定定定待待待待测测测测酶酶酶酶的的的的产产产产物物物物，如如如如转转转转氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。第18页/共96页第十九页，共96页。葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖O2H2O 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸葡萄糖酸H2O2H2O2苯酚苯酚4-氨基安替比林氨基安替比林 过过氧化物氧化物(u yn hu w)酶酶 醌醌亚胺亚胺H2O尿素尿素尿素尿素H2O 脲酶脲酶 2NH4+CO2NH4+-酮戊二酸酮戊二酸NADH 谷谷氨
18、酸脱氢酶氨酸脱氢酶 谷氨谷氨酸酸NAD+H2O第19页/共96页第二十页，共96页。肌酸激酶（肌酸激酶（肌酸激酶（肌酸激酶（CKCK）磷酸磷酸磷酸磷酸(ln sun)(ln sun)肌酸肌酸肌酸肌酸ADP CK ADP CK 肌酸肌酸肌酸肌酸ATPATP葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖ATP HK ATP HK 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸磷酸磷酸(ln sun)(ln sun)ADPADP葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸磷酸磷酸(ln sun)(ln sun)NADP G6PDH NADP G6PDH 6-6-磷酸磷酸磷酸磷酸(ln sun)(ln sun)葡萄糖酸葡萄糖酸葡
19、萄糖酸葡萄糖酸NADPHNADPHH+H+丙氨酸氨基转移酶（丙氨酸氨基转移酶（丙氨酸氨基转移酶（丙氨酸氨基转移酶（ALTALT）丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸-酮戊二酸酮戊二酸酮戊二酸酮戊二酸 ALT ALT 丙酮酸谷氨酸丙酮酸谷氨酸丙酮酸谷氨酸丙酮酸谷氨酸丙酮酸丙酮酸丙酮酸丙酮酸NADHNADHH+LDH H+LDH 乳酸乳酸乳酸乳酸NAD+NAD+H2OH2O第20页/共96页第二十一页，共96页。酶催化酶催化(cu hu)特点特点n n高度的特异性n n高催化效率n n作用(zuyng)条件温和第21页/共96页第二十二页，共96页。酶的活性部位酶的活性部位n n底物(d w)结合部位n n催
20、化部位第22页/共96页第二十三页，共96页。酶的辅助因子酶的辅助因子n n金属离子(lz)n n辅基和辅酶n nNAD，NADP第23页/共96页第二十四页，共96页。酶的分类酶的分类(fn li)n n1.1.氧化氧化(ynghu)(ynghu)还原酶还原酶n n2.2.转移酶转移酶n n3.3.水解酶水解酶n n4.4.裂合酶裂合酶n n5.5.异构酶异构酶n n6.6.合成酶合成酶第24页/共96页第二十五页，共96页。酶的系统酶的系统(xtng)命名命名n n应将酶的一种或两种底物以及催化反应将酶的一种或两种底物以及催化反应的性质应的性质(xngzh)(xngzh)明确标明。明确标明
21、。n n乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶n n L-L-乳酸：乳酸：NAD+NAD+氧化还原酶氧化还原酶n n肌酸激酶肌酸激酶n n ATP ATP：肌酸磷酸转移酶：肌酸磷酸转移酶第25页/共96页第二十六页，共96页。酶的活性单位酶的活性单位(dnwi)n n一国际(guj)单位为在一分钟内催化转变1个微摩尔的反应物的酶量.n nIUU U/Ln n1Katal为每秒钟转化1mole底物的酶量n n1国际(guj)单位=16.67nKataln n1Katal=6107国际(guj)单位第26页/共96页第二十七页，共96页。酶活性测定酶活性测定(cdng)n n影响酶活性测定：底物、激活剂、抑制影响酶
22、活性测定：底物、激活剂、抑制剂、缓冲液、剂、缓冲液、pHpH、温度、酶浓度。、温度、酶浓度。n n在最适条件下以求达到最大的反应速度在最适条件下以求达到最大的反应速度(fn yng s d)(fn yng s d)。n n但由于底物的溶解度低，或售价太高，但由于底物的溶解度低，或售价太高，或需连锁的酶反应，则必须对测定条件或需连锁的酶反应，则必须对测定条件作修正。作修正。第27页/共96页第二十八页，共96页。酶活性测定酶活性测定酶活性测定酶活性测定(cdng)(cdng)的最适条件的最适条件的最适条件的最适条件1.1.1.1.合适的底物、辅因子、活化合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类剂
23、、变构剂的种类(zhngli)(zhngli)和浓度和浓度2.2.2.2.指示酶和辅助酶的种类指示酶和辅助酶的种类(zhngli)(zhngli)和浓度和浓度3.3.3.3.反应混合液的最适反应混合液的最适pHpH，缓冲，缓冲液种类液种类(zhngli)(zhngli)和浓度和浓度4.4.4.4.去除各种抑制剂去除各种抑制剂第28页/共96页第二十九页，共96页。酶促反应酶促反应(fnyng)的两个阶段的两个阶段 反应级数反应级数 0 0级级 1 1级级 P 1.P 1.可逆反应可逆反应 2.2.产物抑制产物抑制 3.3.酶变性失活酶变性失活 v=dP/dt 4.v=dP/dt 4.底物底物(
24、d(d w)w)不饱和不饱和 S S 时间时间 t t第29页/共96页第三十页，共96页。酶反应进程酶反应进程(jnchng)和酶浓度和酶浓度曲线曲线 酶量E 40 1.E越大，线性反 产 应期越短 物 2.E相同，S越小，P 20 线性反应(fnyng)期越短 10 5 0 5 10 15 20 时间(min)第30页/共96页第三十一页，共96页。酶反应时间曲线酶反应时间曲线酶反应时间曲线酶反应时间曲线(qxin)(qxin)时间(shjin)(min)5(t0)反应时间(shjin)越短，10(t1)线性范围越大 15(t2)20(t3)0 10 20 30 40 酶量E第31页/共9
25、6页第三十二页，共96页。米氏方程米氏方程(fngchng)E +SESE +Pkkkk+1+2-2-1v=VSKm+SvV2S Km第32页/共96页第三十三页，共96页。米氏曲线米氏曲线(qxin)SVVmaxKmVmax 2KmKm第33页/共96页第三十四页，共96页。米氏常数米氏常数(chngsh)n n米米-孟氏公式：孟氏公式：v vVmS/(KmVmS/(KmS)S)n n当当SKmSKmSKm时，则时，则v vVmVm，即反应，即反应(fnyng)(fnyng)速度是一个常数，为零速度是一个常数，为零级反应级反应(fnyng)(fnyng)。n n如如SSKmKm时，混合级反应
26、时，混合级反应(fnyng)(fnyng)。第34页/共96页第三十五页，共96页。米氏常数米氏常数(chngsh)的意义的意义n n如如v v0.5Vm0.5Vm，则，则KmKmSS，KmKm值值等于酶促反应的初速度为最大等于酶促反应的初速度为最大速度的一半时所需的底物浓度。速度的一半时所需的底物浓度。n nKmKm等于等于ESES的解离常数；而的解离常数；而KmKm的的倒数可代表倒数可代表(dibio)(dibio)酶和底物酶和底物的亲和力。的亲和力。n nKmKm是酶的特征性常数，当是酶的特征性常数，当pHpH、温度和离子强度恒定时，温度和离子强度恒定时，KmKm只只和酶及底物的性质有关
27、，而与和酶及底物的性质有关，而与酶浓度无关。酶浓度无关。n n纯度不同的同一种酶，如杂质纯度不同的同一种酶，如杂质中没有可使底物发生旁反应的中没有可使底物发生旁反应的其它酶或酶的激活剂和抑制剂，其它酶或酶的激活剂和抑制剂，则则KmKm的变化不大。的变化不大。第35页/共96页第三十六页，共96页。米氏常数米氏常数(chngsh)的应用的应用（1 1 1 1）如已知酶的）如已知酶的）如已知酶的）如已知酶的KmKmKmKm，可计算，可计算，可计算，可计算(j sun)(j sun)(j sun)(j sun)某一底物浓度时的某一底物浓度时的某一底物浓度时的某一底物浓度时的v/Vmv/Vmv/Vmv
28、/Vm。（2 2 2 2）如要求）如要求）如要求）如要求v v v v占占占占VmVmVmVm一定的百分比，也可一定的百分比，也可一定的百分比，也可一定的百分比，也可算出所需底物浓度为其算出所需底物浓度为其算出所需底物浓度为其算出所需底物浓度为其KmKmKmKm的多少倍。的多少倍。的多少倍。的多少倍。（3 3 3 3）利用工具酶来测定某一底物的浓度）利用工具酶来测定某一底物的浓度）利用工具酶来测定某一底物的浓度）利用工具酶来测定某一底物的浓度时，可计算时，可计算时，可计算时，可计算(j sun)(j sun)(j sun)(j sun)工具酶的用量。工具酶的用量。工具酶的用量。工具酶的用量。第
29、36页/共96页第三十七页，共96页。（4 4）测定几个同工酶对同一）测定几个同工酶对同一(tngy)(tngy)底物的底物的KmKm，可估计是原级，可估计是原级（Km Km常有差异）还是次生性同工常有差异）还是次生性同工酶（酶（Km Km接近或相同）。接近或相同）。（5 5）测定正逆方向底物的）测定正逆方向底物的KmKm，可大，可大体知道该酶催化哪一方向为主。体知道该酶催化哪一方向为主。（6 6）如已知一组酶中各酶的）如已知一组酶中各酶的KmKm及其及其相应底物的浓度，有助于寻找限速相应底物的浓度，有助于寻找限速步骤。步骤。第37页/共96页第三十八页，共96页。KmKm的求取的求取(qi
30、q)(qi q)n nLineweaver-Burk作图法作图法n n 1/v(Km/Vm)(1/S)1/Vmn nEadie-Hofstee作图法作图法n n vVmKm(v/S)n nEisenthal和和Cornish-Bowden作作图法图法n n 设设Y轴和轴和X轴分别为求取轴分别为求取Vm及及Km的座标的座标(zu bio)，将，将不同不同S浓度点在浓度点在X轴的负侧；相轴的负侧；相应的反应速度点在应的反应速度点在Y轴上，连接轴上，连接各线，交点在各线，交点在Y轴上的座标轴上的座标(zu bio)为为Vm，在，在X轴上的座标轴上的座标(zu bio)为为Km。第38页/共96页第三
31、十九页，共96页。酶活性测定酶活性测定(cdng)(cdng)的基本的基本知识知识 酶酶酶酶活活活活性性性性是是是是通通通通过过过过测测测测定定定定酶酶酶酶促促促促反反反反应应应应过过过过程程程程中中中中单单单单位位位位时时时时间间间间内内内内底底底底物物物物的的的的减减减减少少少少量量量量或或或或产产产产物物物物(chnw)(chnw)(chnw)(chnw)的的的的生生生生成成成成量量量量，即即即即测测测测定定定定酶酶酶酶促促促促反反反反应应应应的的的的速速速速率率率率来来来来获得的。获得的。获得的。获得的。第39页/共96页第四十页，共96页。（1 1）定时法）定时法 测测定定酶酶反反应
32、应开开始始后后某某一一时时间间内内（t1t1到到t2t2）产产物物或或底底物物浓浓度度(nngd)(nngd)的的总总变变化化量量来来求求取取酶酶反反应初速度的方法称为定时法。应初速度的方法称为定时法。产产 2 2 物物 3 3 生生 1 1 成成 t1 t1 t2t2 第40页/共96页第四十一页，共96页。（2 2）连续监测法）连续监测法 连连续续测测定定（每每15s15s1min1min监监测测一一次次）酶酶反反应应过过程程中中某某一一反反应应产产物物或或底底物物(d(d w)w)的的浓浓度度随随时时间间的的变变化化来来求求出出酶酶反反应应初初速速度度的的方方法法称称为为连连续续监监测测
33、法法，又又称称动动力力学学法法或或速速率率法法。这这种种方方法法的的优优点点是是可可将将多多点点的的测测定定结结果果连连接接成成线线，很很易易找找到到成成直直线线的的区区段段，来来计计算算酶酶活活性性。此此法法较为准确。较为准确。分分为为直直接接连连续续监监测测法法和和间间接接连续监测法。连续监测法。法法.第41页/共96页第四十二页，共96页。连续监测连续监测(jin c)法的测定时间法的测定时间 吸 光 度 A3 A2 A1 t1 t2 t3 t4 时间(shjin)第42页/共96页第四十三页，共96页。（3 3 3 3）平衡法）平衡法）平衡法）平衡法 通通通通过过过过测测测测定定定定酶
34、酶酶酶反反反反应应应应开开开开始始始始至至至至反反反反应应应应达达达达到到到到平平平平衡衡衡衡时时时时产产产产物物物物或或或或底底底底物物物物(d(d(d(d w)w)w)w)浓浓浓浓度度度度总总总总变变变变化化化化量量量量来来来来求求求求出出出出酶酶酶酶活活活活性性性性的的的的方方方方法法法法称称称称为为为为平平平平衡衡衡衡法法法法。用用用用平平平平衡衡衡衡法法法法测测测测定定定定时时时时，因因因因产产产产物物物物的的的的增增增增加加加加或或或或底底底底物物物物(d(d(d(d w)w)w)w)的的的的减减减减少少少少与与与与反反反反应应应应时时时时间间间间不不不不成成成成线线线线性性性性，
35、故故故故不不不不能能能能把把把把PPPP或或或或SSSS的的的的总总总总变变变变化化化化量量量量除除除除以以以以t t t t来来来来代代代代表表表表每每每每分分分分钟钟钟钟产产产产物物物物或或或或底底底底物物物物(d(d(d(d w)w)w)w)的的的的变变变变化化化化。另另另另外外外外，平平平平衡衡衡衡法法法法也也也也会会会会受受受受到到到到产产产产物物物物抑抑抑抑制制制制、可可可可逆逆逆逆反反反反应应应应等等等等因因因因素素素素的的的的影影影影响响响响，由由由由于于于于反反反反应应应应时时时时间间间间较较较较定定定定时时时时法法法法长长长长，故故故故这这这这种种种种影影影影响响响响会会会
36、会更更更更大大大大，测测测测定定定定结结结结果果果果也也也也较较较较连连连连续续续续监监监监测测测测法法法法低低低低。对对对对于于于于有有有有些些些些零零零零级级级级反反反反应应应应期期期期很很很很短短短短的的的的酶酶酶酶促促促促反反反反应应应应，用用用用连连连连续续续续监监监监测测测测法法法法和和和和定定定定时时时时法法法法很很很很难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。第43页/共96页第四十四页，共96页。定时法与连续定时法与连续(linx)法比较法比较n n定时法定时法n n
37、条件条件(tiojin)无限制无限制n n试剂需量少，试剂需量少，经济经济n n采用放射性采用放射性试剂时，灵试剂时，灵敏度高敏度高n n结果不能立结果不能立刻揭晓刻揭晓n n人工操作多，人工操作多，费时费时n n毋需偶联酶毋需偶联酶n n产物会生抑产物会生抑制作用制作用n n连续法连续法n n因偶联酶使因偶联酶使条件受限制条件受限制n n需量较大需量较大n n与放射性试与放射性试剂来比，灵剂来比，灵敏度低敏度低n n结果立刻揭结果立刻揭晓晓n n人工人工(rngng)操操作少作少n n偶联酶的费偶联酶的费用很大用很大n n偶联作用能偶联作用能消耗产物消耗产物第44页/共96页第四十五页，共9
38、6页。（一）工具（一）工具(gngj)酶及酶偶联反应酶及酶偶联反应 通通通通过过过过酶酶酶酶偶偶偶偶联联联联反反反反应应应应(f(f nyng)nyng)间间间间接接接接地地地地测测测测出出出出第第第第一一一一个个个个酶酶酶酶促促促促反反反反应应应应(f(f nyng)nyng)中中中中待待待待测测测测物物物物的的的的浓浓浓浓度度度度或或或或待待待待测测测测酶酶酶酶的的的的活活活活性性性性。那那那那些些些些作作作作为为为为试试试试剂剂剂剂用用用用于于于于测测测测定定定定化化化化合合合合物物物物浓浓浓浓度度度度或或或或酶活性的酶称为工具酶。酶活性的酶称为工具酶。酶活性的酶称为工具酶。酶活性的酶称
39、为工具酶。第45页/共96页第四十六页，共96页。AB 酶1 CDC（或D）E 酶2 FGF（或G）H 酶3 IJ酶1：待测酶酶2：辅助酶酶3：指示(zhsh)酶E、H：辅助底物第46页/共96页第四十七页，共96页。n n在利用工具酶的反应中，唯一的限在利用工具酶的反应中，唯一的限在利用工具酶的反应中，唯一的限在利用工具酶的反应中，唯一的限速因子应该速因子应该速因子应该速因子应该(ynggi)(ynggi)是待测化合物或是待测化合物或是待测化合物或是待测化合物或待测酶。待测酶。待测酶。待测酶。n n对工具酶试剂中的杂质（杂酶、抑对工具酶试剂中的杂质（杂酶、抑对工具酶试剂中的杂质（杂酶、抑对工
40、具酶试剂中的杂质（杂酶、抑制剂等）的含量也有一定的限制，制剂等）的含量也有一定的限制，制剂等）的含量也有一定的限制，制剂等）的含量也有一定的限制，以减少或避免干扰测定的副反应。以减少或避免干扰测定的副反应。以减少或避免干扰测定的副反应。以减少或避免干扰测定的副反应。第47页/共96页第四十八页，共96页。如果工具酶制剂中污染了待测酶会对测定结果(ji gu)产生严重影响。如天冬氨酸转氨酶（AST）测定的工具酶是苹果酸脱氢酶（MDH），如污染0.03%的AST，则当AST活性为7U/L时，测定误差为6%。而测定丙氨酸转氨酶（ALT）的工具酶是乳酸脱氢酶（LDH），如污染0.03%的ALT，则当A
41、LT活性为5U/L时测定误差也是6%。第48页/共96页第四十九页，共96页。（二）常用监测（二）常用监测(jin c)物质的特性物质的特性1 1NADHNADH或或NADPHNADPH：乳乳 酸酸(r(r sun)sun)脱脱 氢氢 酶酶（LDHLDH）NAD+NAD+或或NADP+NADP+苹苹果果酸酸脱脱氢氢酶酶（MDHMDH）NAD+NAD+或或NADP+NADP+谷谷氨氨酸酸脱脱氢氢酶酶（GLDHGLDH）NAD+NAD+或或NADP+NADP+6-6-磷酸葡萄糖脱氢酶（磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDG6PD）动物动物G6PD NADP+G6PD NADP+微生物微生物G6PD NAD+
42、G6PD NAD+第49页/共96页第五十页，共96页。n nNADHNADHNADHNADH或或或或NADPHNADPHNADPHNADPH在在在在340nm340nm340nm340nm有有有有特特特特征征征征性性性性光光光光吸吸吸吸收收收收(xshu)(xshu)(xshu)(xshu)，而而而而 它它它它 们们们们 的的的的 氧氧氧氧 化化化化 型型型型 NAD+NAD+NAD+NAD+或或或或NADP+NADP+NADP+NADP+则则则则 没没没没 有有有有 这这这这 个个个个 吸吸吸吸 收收收收(xshu)(xshu)(xshu)(xshu)峰峰峰峰，340nm340nm340n
43、m340nm波波波波长长长长处处处处的的的的吸吸吸吸光光光光度度度度与与与与NADNADNADNAD（P P P P）H H H H的的的的浓浓浓浓度成正比。度成正比。度成正比。度成正比。n n另另另另外外外外NADNADNADNAD（P P P P）H H H H有有有有强强强强烈烈烈烈的的的的荧荧荧荧光光光光，其其其其激激激激发发发发波长为波长为波长为波长为340nm340nm340nm340nm，发射波长为，发射波长为，发射波长为，发射波长为460nm460nm460nm460nm。第50页/共96页第五十一页，共96页。max：340nm第51页/共96页第五十二页，共96页。肌酸激酶
44、（肌酸激酶（肌酸激酶（肌酸激酶（CKCK）磷酸磷酸磷酸磷酸(ln sun)(ln sun)肌酸肌酸肌酸肌酸ADP CK ADP CK 肌酸肌酸肌酸肌酸ATPATP葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖ATP HK ATP HK 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸磷酸磷酸(ln sun)(ln sun)ADPADP葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸磷酸磷酸(ln sun)(ln sun)NADP G6PDH NADP G6PDH 6-6-磷酸磷酸磷酸磷酸(ln sun)(ln sun)葡萄糖酸葡萄糖酸葡萄糖酸葡萄糖酸NADPHNADPHH+H+丙氨酸氨基转移酶（丙氨酸氨基转移酶（丙氨酸氨基转移
45、酶（丙氨酸氨基转移酶（ALTALT）丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸-酮戊二酸酮戊二酸酮戊二酸酮戊二酸 ALT ALT 丙酮酸谷氨酸丙酮酸谷氨酸丙酮酸谷氨酸丙酮酸谷氨酸丙酮酸丙酮酸丙酮酸丙酮酸NADHNADHH+LDH H+LDH 乳酸乳酸乳酸乳酸NAD+NAD+H2OH2O第52页/共96页第五十三页，共96页。2 2 2 2H2O2H2O2H2O2H2O2指示指示指示指示(zhsh)(zhsh)(zhsh)(zhsh)反应反应反应反应n n葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖氧氧氧氧化化化化酶酶酶酶、尿尿尿尿酸酸酸酸酶酶酶酶、甘甘甘甘油油油油(n(n(n(n yu)yu)yu)yu)氧氧氧氧化化化化酶酶酶酶、
46、胆胆胆胆固固固固醇醇醇醇氧氧氧氧化化化化酶酶酶酶：用用用用于于于于葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖、尿尿尿尿酸酸酸酸、甘甘甘甘油油油油(n(n(n(n yu)yu)yu)yu)、胆胆胆胆固固固固醇醇醇醇的的的的测测测测定定定定，可可可可使使使使相相相相应应应应底底底底物物物物被被被被O2O2O2O2氧氧氧氧化化化化成成成成H2O2H2O2H2O2H2O2，H2O2H2O2H2O2H2O2可可可可通通通通过过过过下下下下列列列列指指指指示示示示反反反反应应应应来来来来检检检检测。测。测。测。第53页/共96页第五十四页，共96页。使使单单一一的的色色素素原原显显色色。无无色色(w(w s)s)色色 素素
47、 原原 过过 氧氧 化化 物物 酶酶（PODPOD）存存在在下下被被H2O2H2O2氧氧化化后后可生成有色的色素。可生成有色的色素。使使成成对对的的色色素素原原显显色色。必必须须要要两两个个色色素素原原共共同同存存在在，再再在在指指示酶示酶PODPOD的催化下生成色素。的催化下生成色素。发发光光反反应应。H2O2H2O2也也可可用用化化学学发发光光反反应应来来监监测测，它它是是凭凭借借某某些些荧荧光光前前身身物物在在氧氧化化后后，处处于于激激发发状状态态的的分分子子可可发发射射光光子子，光光子子量量和和H2O2H2O2的浓度成正比。的浓度成正比。第54页/共96页第五十五页，共96页。葡萄糖葡
48、萄糖葡萄糖葡萄糖O2H2O 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸葡萄糖酸H2O2H2O2苯酚苯酚4-氨基安替比林氨基安替比林 过过氧化物氧化物(u yn hu w)酶酶 醌亚醌亚胺胺H2O甘油三酯甘油三酯甘油三酯甘油三酯H2O 脂蛋白脂酶脂蛋白脂酶 甘油甘油脂肪酸脂肪酸甘油甘油ATP 甘油激酶甘油激酶 -磷酸甘油磷酸甘油ADP -磷酸甘油磷酸甘油O2 甘油磷酸氧化酶甘油磷酸氧化酶 磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮H2O2 H2O2+4-氨基安替比林氨基安替比林+ESPAS 过氧化物过氧化物(u yn hu w)酶酶 醌醌亚胺亚胺H2O ESPAS:N-乙基乙基-N-(3-磺丙基磺丙基)-间间-茴茴香胺香
49、胺第55页/共96页第五十六页，共96页。3 3硝基苯衍生物硝基苯衍生物硝基苯衍生物硝基苯衍生物n n芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：对对-硝基硝基(xio j)(xio j)酚和有机酸或酚和有机酸或无机酸形成的酯类无机酸形成的酯类n n糖苷酶：对硝基糖苷酶：对硝基(xio j)(xio j)酚和糖酚和糖苷衍生物苷衍生物n n-谷氨酰转肽酶、芳香酰胺酶和谷氨酰转肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶：对胰蛋白酶：对-硝基硝基(xio j)(xio j)苯苯胺的氨基酰衍生物胺的氨基酰衍生物n n故硝基故硝基(xio j)(xio j)苯酚或硝基苯酚或硝基(xio j)(xio j
50、)苯胺作为底物的结合苯胺作为底物的结合型化合物均无色，而一旦水解或型化合物均无色，而一旦水解或游离型产物在游离型产物在pHpH大于大于8 8的碱性条的碱性条件下能生成黄色的醌类离子型化件下能生成黄色的醌类离子型化合物，在合物，在400nm400nm410nm410nm有光吸收有光吸收峰，其吸光度与浓度成正比。峰，其吸光度与浓度成正比。第56页/共96页第五十七页，共96页。max：405nm第57页/共96页第五十八页，共96页。碱性碱性碱性碱性(jin xn)(jin xn)(jin xn)(jin xn)磷酸酶（磷酸酶（磷酸酶（磷酸酶（ALPALPALPALP）磷酸对硝基苯磷酸对硝基苯磷酸