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1、质粒酶切鉴定第1页，本讲稿共36页1.实验目的和要求实验目的和要求 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是限制性内切酶是DNA重组技术的关键工重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片片段的有效方法。段的有效方法。第2页，本讲稿共36页2.相关基础知识相关基础知识 限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶：是是一一类类能能识识别别双双链链DNA分分子子特特异异性性核核酸酸序序列列的的DNA水水解解酶酶。是是体体外外剪剪切切基基因因片片段段的的重重要要工工
2、具具，所所以以常常常常与与核核酸酸聚聚合合酶酶、连连接接酶酶以以及及末末端端修修饰饰酶酶等等一一起起称称为为工工具具酶酶。限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶不不仅仅是是DNA重重组组中中重重要要的的工工具具，而而且且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。第3页，本讲稿共36页1)寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象2)核酸限制性内切酶的类型核酸限制性内切酶的类型3)核酸限制性内切酶的基本特性核酸限制性内切酶的基本特性4)同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶5)核酸限制性内切酶的命名法核酸限制性内切酶的命名法6)影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的
3、因素第4页，本讲稿共36页1)寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各种细各种细菌都能合成一种或几种能够切割菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能不能起作用。这种现象被称为寄主控
4、制的限制与修饰起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。现象。第5页，本讲稿共36页2)限制性核酸内切酶的类型及特性限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：的情况不同，分为三类：型型 型型*型型第6页，本讲稿共36页第一类（第一类（I I型）限制性内切酶型）限制性内切酶能识别专一的核能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割切割DNADNA分子中的双链，但是切割的核苷酸分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内顺序
5、没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在切酶在DNADNA重组技术或基因工程中用处不大，重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析无法用于分析DNADNA结构或克隆基因。这类酶结构或克隆基因。这类酶如如EcoBEcoB、EcoKEcoK等。等。第7页，本讲稿共36页第第二二类类(II(II型型)限限制制性性内内切切酶酶能能识识别别专专一一的的核核苷苷酸酸顺顺序序，并并在在该该顺顺序序内内的的固固定定位位置置上上切切割割双双链链。由由于于这这类类限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别和和切切割割的的核核苷苷酸酸都都是是专专一一的的。因因此此，这这种种限限制制性性内内切切酶酶是是DNADNA重重组组
6、技技术术中中最最常常用用的的工工具具酶酶之之一一。这这种种酶酶识识别别的的专专一一核核苷苷酸酸顺顺序序最最常常见见的的是是4 4个个或或6 6个个核核苷苷酸酸，少少数数也也有有识识别别5 5个个核核苷苷酸酸以以及及7 7个个、8 8个个、9 9个个、1010个个和和1111个个核核苷苷酸酸的的。II II 型型限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别顺顺序序是是一一个个回回文文对对称称顺顺序序，即即有有一一个个中中心心对对称称轴轴，从从这这个个轴轴朝朝二二个个方方向向“读读”都都完完全全相相同同。这这种种酶酶的的切割可以有两种方式：切割可以有两种方式：第8页，本讲稿共36页粘性末端；是交错切割，结
7、果形成两条单链末端，这种末粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。端。如如EcoRIEcoRI的识别顺序为：的识别顺序为：5 GAA|TT_C 3 5 GAA|TT_C 3 3 C_TT|AAG 5 3 C_TT|AAG 5垂垂直直线线表表示示中中心心对对称称轴轴，从从两两侧侧“读读”核核苷苷酸酸顺顺序序都都是是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG，这这就就是是回回文文顺顺序序（palindromepalindrome）。_ _和和表表示示在在双双链链上上交交错错切
8、切割割的的位位置置，切切割割后后生生成成5G5G和和AATTC3AATTC3、3CTTAA3CTTAA和和G5G5二二个个DNADNA片片段段，各各有有一一个个单单链链末末端端，二二条条单单链链是是互互补补的的，其其断断裂裂的的磷磷酸酸二二酯酯键键以以及氢键可通过及氢键可通过DNADNA连接酶的作用而连接酶的作用而“粘合粘合”。第9页，本讲稿共36页IIII型酶切割方式的另一种是在同一位置上切型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如割双链，产生平头末端。例如EcoRV EcoRV 的识别位的识别位置是：置是：5 GAT|ATC 35 GAT|ATC 33 CTA|TAG
9、5 3 CTA|TAG 5 切割后形成切割后形成5 GAT5 GAT和和ATC 3ATC 3、3 CTA3 CTA和和TAG 5TAG 5。这种末端同。这种末端同样可以通过样可以通过DNADNA连接酶连接起来。连接酶连接起来。平头末端：平头末端：第10页，本讲稿共36页第三类（第三类（IIIIII型）限制性内切酶型）限制性内切酶也有专一的识别也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性
10、内切酶切割后产生的一定长度内切酶切割后产生的一定长度DNADNA片段，具有各片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。种单链末端。因此不能应用于基因克隆。第11页，本讲稿共36页同裂酶：同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如内切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaHpa和和MspMsp的识别顺序都是的识别顺序都是5GCG_G35GCG_G3，如果其中有，如果其中有5-5-
11、甲基胞嘧啶，则只有甲基胞嘧啶，则只有HpaHpa能够切割。这些能够切割。这些有相同切点的酶称为有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异同裂酶（同切酶或异源同工酶）源同工酶）。3）同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：第12页，本讲稿共36页有时两种酶切割序列不完全相同，但却能有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾同尾酶酶，可以通过，可以通过DNADNA连接酶将这类末端连接起连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。如会产生一个新的酶切位点。如Xba1Xba1、
12、Nhe1Nhe1、Spe1Spe1以及以及StylStyl切割的切割的DNADNA序列不同，但均给出序列不同，但均给出相同的相同的“CTAG”CTAG”粘性末端。这些粘性末端连粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的一个新的4 4核苷酸的酶切位点，即核苷酸的酶切位点，即 Bfa1Bfa1的酶的酶切位点。切位点。同尾酶：同尾酶：第13页，本讲稿共36页4)限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法v用用属属名名的的头头一一个个字字母母和和种种名名的的头头两两个个字字母母表表示示寄寄主主菌菌的的物物种种名名称称，如如E.co
13、li 用用Eco表表示示，所以用斜体字。所以用斜体字。v用用一一个个字字母母代代表表菌菌株株或或型型，如如流流感感嗜嗜血血菌菌Rd菌株用菌株用d，即，即Hind。v如如果果一一种种特特殊殊的的寄寄主主菌菌株株，具具有有几几个个不不同同的的限限制制与与修修饰饰体体，则则以以罗罗马马数数字字表表示示，如如Hind,Hind，Hind等。等。第14页，本讲稿共36页5)影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素(1)DNA的纯度；的纯度；(2)DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3)酶切消化反应的温度；酶切消化反应的温度；(4)DNA的分子结构；的分子结构；(5)溶液中离子浓度及种
14、类；溶液中离子浓度及种类；(6)缓冲液的缓冲液的 pH值。值。第15页，本讲稿共36页琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的缓冲条件的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。影响影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素：在琼脂糖中迁移率的因素：DNA分子的分子的大小、大小、DNA的构象、电压、电场方向、碱基组成、的构象、电压、电场
15、方向、碱基组成、嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组成。嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组成。第16页，本讲稿共36页琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状DNA的迁移率，因此采用不同浓度的凝胶可的迁移率，因此采用不同浓度的凝胶可以分离不同大小范围的以分离不同大小范围的DNA片段。片段。0.8%的琼脂糖凝胶能很好地分辨的琼脂糖凝胶能很好地分辨1-25kb的的片段；片段；0.5%的琼脂糖凝胶用于分辨较的琼脂糖凝胶用于分辨较大片段的大片段的DNA(20-100kb）；对于小片）；对于小片段的段的DNA(0.2-2kb)可用可用1.5%或更高浓度或更高浓度的凝胶进行分离。不过，以上这些并
16、不是的凝胶进行分离。不过，以上这些并不是绝对的，因为有时我们需要同时分离多种绝对的，因为有时我们需要同时分离多种分子量相差较大的片段，因此所用琼脂糖分子量相差较大的片段，因此所用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而定。凝胶的浓度要视情况而定。第17页，本讲稿共36页EBEB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲锭溴盐苯基菲锭溴盐,(Ethidium Bromide)(Ethidium Bromide)。它能够插入。它能够插入DNADNA分子分子中的碱基对之间而与中的碱基对之间而与DNADNA结合。由于结合。由于EBEB分子分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的的插入，
17、在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNADNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测检测10ng 10ng 的的DNADNA。注意：注意：EBEB是一种诱变剂，操作时一定是一种诱变剂，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套手套。第18页，本讲稿共36页3.3.实验材料与仪器实验材料与仪器质粒质粒 pCMV-Myc-T10pCMV-Myc-T10NEB NEB 标准分子量片段标准分子量片段(1kb DNA Ladder)(1kb DNA Ladder)EcoR1 EcoR1 和和 Xho1 Xho1 核酸内切酶（核酸内切酶（T
18、akaraTakara）EcoR 1和 Xho 1酶解缓冲液酶解缓冲液(10H buffer)(10H buffer)琼脂糖琼脂糖TBETBE或或TAETAE缓冲液缓冲液(10)(10)溴化乙啶染色液溴化乙啶染色液(10mg/ml)(10mg/ml)上样液上样液(6)(6)：0.25%0.25%溴酚兰，溴酚兰，4040(W/V)(W/V)蔗糖蔗糖 水溶液或水溶液或3030的甘油。的甘油。第19页，本讲稿共36页InsertEcoR1Xho11.9kb质粒质粒第20页，本讲稿共36页第21页，本讲稿共36页1 kb DNA Ladder1 kb DNA Ladder不能对不能对DNADNA质质量
19、进行精确定量分析，但可以通量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大概的量如大概的数据。每条带大概的量如下（按下（按0.5g0.5g上样量计。应按上样量计。应按1212条带计算，因为条带计算，因为3kb3kb的量是其的量是其它片段量的近三倍）：它片段量的近三倍）：片段碱基对质量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*第22页，
20、本讲稿共36页EcoR I 酶切位点：酶切位点：GAATT_CXho I 酶切位点：酶切位点：CTCGA_G10H buffer:500mM Tris-HCl(pH7.5)10H buffer:500mM Tris-HCl(pH7.5)100mM MgCl 100mM MgCl2 2 10mM Dithiothreitol 10mM Dithiothreitol 1000mM NaCl 1000mM NaCl第23页，本讲稿共36页酶活性的定义：酶活性的定义：一个活性单位（一个活性单位（U)U)，是指在，是指在5050 l l反应体系中，反应体系中，3737o oC C的条件下，经过的条件下，
21、经过1 1小时的反应时间，将小时的反应时间，将1 1 g g DNA DNA 完全酶解所需要的酶量。完全酶解所需要的酶量。因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，所因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公司会给用户提供这方面的信息。司会给用户提供这方面的信息。第24页，本讲稿共36页电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑
22、料手套等胶成像仪，一次性塑料手套等第25页，本讲稿共36页4.实验方法和步骤实验方法和步骤 第26页，本讲稿共36页质粒量质粒量质粒量质粒量（ngngngng）缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液(l)*(l)*(l)*(l)*EcoREcoREcoREcoR1 1 1 1（llll）XhoXhoXhoXho1 1 1 1（llll）H H H H2 2 2 2O O O O(l)(l)(l)(l)总体积总体积总体积总体积（llll）I I I I2002002002002 2 2 20 0 0 00 0 0 017-1917-1917-1917-1920202020IIIIIIII20020020020
23、02 2 2 20.50.50.50.50 0 0 015-1715-1715-1715-1720202020IIIIIIIIIIII2002002002002 2 2 20.50.50.50.50.50.50.50.514-1614-1614-1614-1620202020*缓冲液随不同的酶而不同缓冲液随不同的酶而不同,本实验用本实验用 H bufferH buffer。置于置于3737水浴酶解水浴酶解0.5-10.5-1小时。酶解完成后，分别加小时。酶解完成后，分别加入入1010 l l 3 3倍的上样缓冲液倍的上样缓冲液,然后各取然后各取1515 l l进行电泳分进行电泳分析。析。1)质
24、粒质粒DNA的酶解（自提质粒的酶解（自提质粒pCMV-Myc-T10）第27页，本讲稿共36页2)琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶液的制备：称取琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8g琼脂糖，琼脂糖，置于三角瓶中，加入置于三角瓶中，加入100ml TBE或或TAE工作工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。置于微波炉加直至琼脂溶解。第28页，本讲稿共36页3）胶板的制备）胶板的制备取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条(宽宽约约1cm)，将有机玻璃内槽置于一水平位置模，将有机玻璃内槽置于一水平位置
25、模具上，放好梳子。具上，放好梳子。第29页，本讲稿共36页将冷却至将冷却至65左右的琼脂糖凝胶液，小心左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置室温下静置30min左右，待凝固完全后，左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有槽放在含有0.5-1TAE（Tris-乙酸）乙酸）或或
26、TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用。硼酸）工作液的电泳槽中使用。第30页，本讲稿共36页4）加样）加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约约1520 l。1 kb DNA ladder（共（共10条带）条带）:在第一个上在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入样孔或最后一个上样孔内加入6 l 的的 1 kb DNA ladder（50ng
27、/l）。）。第31页，本讲稿共36页5）电泳（带上手套操作）电泳（带上手套操作）加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；建议在建议在80100V的电压下电泳；的电压下电泳；当溴酚兰移动到距离胶板下沿约当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止处停止电泳；电泳；将凝胶放入将凝胶放入溴化乙啶（溴化乙啶（EB工作液工作液（0.5 g/ml左右）中染色约左右）中染色约20min。第32页，本讲稿共36页为了获得电泳分离为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，片段的最大分辨率，电场强度不应高于电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）（两电极间的距离）。电泳温度视需要而定，对
28、大分子的分。电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。离，以低温较好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太时，由于胶太稀，最好在稀，最好在4进行电泳以增加凝胶硬度。进行电泳以增加凝胶硬度。第33页，本讲稿共36页6）观察与拍照）观察与拍照在紫外灯在紫外灯(310nm波长波长)下观察染色后的凝胶。下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。紫外存在处显示出红色的荧光条带。紫外光激发光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻在紫外灯下观察时，应戴上防护眼
29、镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。第34页，本讲稿共36页对对于于未未进进行行酶酶切切的的质质粒粒来来说说，常常会会出出现现两两条条电电泳泳带带，一一条条是是（松松弛弛）螺螺旋旋状状质质粒粒DNADNA带带，另另一一条条是是超超螺螺旋旋状状质质粒粒DNADNA的的带带，以以超超螺螺旋旋状状质质粒粒DNADNA居居多多，移移动动速速度度也也最最快快。有有时时还还会会出出现现三三条条带带，其其中中一一条条是是因因为为有有一一些些质质粒粒DNADNA在在提提取取过过程程中中遭遭到到损损伤伤而而线线性性化化，其其移移动动速速度度介介于于螺螺旋旋状状和和超超螺螺旋旋状状质质粒粒DNADNA之之间间，所所以以该该条条电电泳泳带带也也位位于于上上述述两两种种带带之之间间。如如果果提提取取的的质质粒粒很很好好时时，这这条条带带会会很很弱弱，有有时时看看不不到。到。第35页，本讲稿共36页Relaxed circleLinearized formSuper-coiled form第36页，本讲稿共36页