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1、1. 实验目的和要求实验目的和要求 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是理解限制性内切酶是DNA重组技术的重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定定DNA片段的有效方法。片段的有效方法。 2. 相关基础知识相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双限制性核酸内切酶：是一类能识别双链链DNA分子特异性核酸序列的分子特异性核酸序列的DNA水水解酶。是体外剪切基因片段的重要工解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶具，所以常常与
2、核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重组中重要的工具，而且还可以用于基因组重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。酶切图谱的鉴定。1) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象2) 核酸限制性内切酶的类型核酸限制性内切酶的类型3) 核酸限制性内切酶的基本特性核酸限制性内切酶的基本特性4) 同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶5) 核酸限制性内切酶的命名法核酸限制性内切酶的命名法6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素1) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制
3、与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各各种细菌都能合成一种或几种能够切割种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双双链的核酸内切酶，链的核酸内切酶，它们以此来限制外源它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自这种酶的细胞自身的身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限进行了修饰，限制性酶对修饰过的制性酶对修饰过的DNA不能起作用。不能起作用。这种现这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。象被称为寄主控制的限制与修饰现象
4、。2)限制性核酸内切酶的类型及特性限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及以及切切断核酸的情况不同，分为三类：断核酸的情况不同，分为三类： 型型 型型* 型型第一类（第一类（I I型）限制性内切酶型）限制性内切酶能识别专一能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割核苷酸上切割DNADNA分子中的双链，但是切分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在这类限制性内切酶在DNADNA重组技术或基因重组技术或基因工程中用处不大，无法
5、用于分析工程中用处不大，无法用于分析DNADNA结构结构或克隆基因。这类酶如或克隆基因。这类酶如EcoBEcoB、EcoKEcoK等。等。 第二类第二类(II(II型型) )限制性内切酶限制性内切酶能识别专一的核能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是切酶是DNADNA重组技术中最常用的工具酶之一。重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是这种酶识别的专一核苷酸顺序
6、最常见的是4 4个或个或6 6个核苷酸，少数也有识别个核苷酸，少数也有识别5 5个核苷酸以个核苷酸以及及7 7个、个、8 8个、个、9 9个、个、1010个和个和1111个核苷酸的。个核苷酸的。 II II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向朝二个方向“读读”都完全相同。这种酶的切都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：割可以有两种方式：粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，这种末端的
7、核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。所以称为粘性末端。如如EcoRIEcoRI的识别顺序为：的识别顺序为： 5 5 GAA|TT_C GAA|TT_C 33 3 3 C_TT|AAG C_TT|AAG 5 5垂直线表示中心对称轴，从两侧垂直线表示中心对称轴，从两侧“读读”核苷酸顺序都是核苷酸顺序都是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG，这就是回文顺序（，这就是回文顺序（palindromepalindrome）。）。_ _和和表示在双链上交错切割的位置，切割后生成表示在双链上交错切割的位置，切割后生成55G G和和AATTCAATTC33、33CTTAACTTAA
8、和和G G55二个二个DNADNA片段，各片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过键以及氢键可通过DNADNA连接酶的作用而连接酶的作用而“粘合粘合”。IIII型酶切割方式的另一种是在同一位置型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV EcoRV 的识别位置是：的识别位置是： 55 GAT|ATC GAT|ATC 3 333 CTA|TAG CTA|TAG 5 5 切割后形成切割后形成55 GAT GAT和和ATC ATC 3 3、 33 CTA CT
9、A和和TAG TAG 5 5。这种末端。这种末端同样可以通过同样可以通过DNADNA连接酶连接起来。连接酶连接起来。平头末端：平头末端：第三类（第三类（ IIIIII型）限制性内切酶型）限制性内切酶也有专一也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序的识别顺序，但不是对称的回文顺序, ,在识在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度定长度DNADNA片段，具有各种单链末端。因此片段，具有各种单链末端。因此不能应用
10、于基因克隆。不能应用于基因克隆。同裂酶：同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如例如HpaHpa和和MspMsp的识别顺序都是的识别顺序都是55GCG_GGCG_G33，如果其中有，如果其中有5-5-甲基胞嘧啶，则只有甲基胞嘧啶，则只有HpaHpa能够切能够切割。这些有相同切点的酶称为割。这些有相同切点的酶称为同裂酶同裂酶（同切酶或异源同工酶）（同切
11、酶或异源同工酶）。 3） 同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：有时两种酶切割序列不完全相同，但却能有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾同尾酶酶，可以通过，可以通过DNADNA连接酶将这类末端连接连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。如可能会产生一个新的酶切位点。如Xba1Xba1、Nhe1Nhe1、Spe1Spe1以及以及StylStyl切割的切割的DNADNA序列不同，序列不同，但均给出相同的但均给出相同的“CTAG”CTAG”粘性末端。这些粘性末
12、端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的但却产生了一个新的4 4核苷酸的酶切位点，核苷酸的酶切位点，即即 Bfa1Bfa1的酶切位点。的酶切位点。同尾酶：同尾酶：4) 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法v 用属名的头一个字母和种名的头两个字母用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用用Eco表表示，所以用斜体字。示，所以用斜体字。v 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株用菌株用d，即，即Hind。v 如果一种特殊的寄
13、主菌株，具有几个不同如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如Hind, Hind，Hind等。等。5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素(1) DNA的纯度；的纯度；(2) DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3) 酶切消化反应的温度；酶切消化反应的温度；(4) DNA的分子结构；的分子结构；(5) 溶液中离子浓度及种类；溶液中离子浓度及种类；(6) 缓冲液的缓冲液的 pH值。值。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔
14、隙的固体基质的特性，其能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。可以向阳极迁移。影响影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素：在琼脂糖中迁移率的因素：DNA分分子的大小、子的大小、DNA的构象、电压、电场方向、的构象、电压、电场方向、碱基组成、嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组碱基组成、嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组成。成。琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状DNA的迁移率，因此采用不同浓度的的迁移率，因此采用不同浓度的
15、凝胶可以分离不同大小范围的凝胶可以分离不同大小范围的DNA片片段。段。0.8%的琼脂糖凝胶能很好地分辨的琼脂糖凝胶能很好地分辨1-25kb的片段；的片段；0.5% 的琼脂糖凝胶用的琼脂糖凝胶用于分辨较大片段的于分辨较大片段的DNA (20-100kb）；）；对于小片段的对于小片段的DNA(0.2-2kb) 可用可用1.5%或更高浓度的凝胶进行分离。不或更高浓度的凝胶进行分离。不过，以上这些并不是绝对的，因为有过，以上这些并不是绝对的，因为有时我们需要同时分离多种分子量相差时我们需要同时分离多种分子量相差较大的片段，因此所用琼脂糖凝胶的较大的片段，因此所用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而定。浓度要视情
16、况而定。EBEB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲锭苯基菲锭溴盐溴盐, (Ethidium Bromide), (Ethidium Bromide)。它能够插它能够插入入DNADNA分子中的碱基对之间而与分子中的碱基对之间而与DNADNA结合。结合。由于由于EBEB分子分子的插入，在紫外光的照射下，的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的凝胶电泳中的DNADNA条带呈现出条带呈现出红色荧光，红色荧光，易于检测。可以检测易于检测。可以检测1010ng ng 的的DNADNA。注意：注意：EBEB是一种诱变剂，操作时一是一种诱变剂，操作时一定要注意安全操作，必须戴
17、塑料或定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套乳胶手套。3. 3. 实验材料与仪器实验材料与仪器 质粒质粒 pCMV-Myc-T10pCMV-Myc-T10 NEB NEB 标准分子量片段标准分子量片段(1kb DNA Ladder)(1kb DNA Ladder)EcoR1 EcoR1 和和 Xho1 Xho1 核酸内切酶（核酸内切酶（TakaraTakara）EcoR 1和 Xho 1酶解缓冲液酶解缓冲液(10(10H buffer)H buffer) 琼脂糖琼脂糖 TBETBE或或TAETAE缓冲液缓冲液(10(10) ) 溴化乙啶染色液溴化乙啶染色液(10mg/ml)(10mg/ml)
18、上样液上样液(6(6) )：0.25% 0.25% 溴酚兰，溴酚兰，4040(W/V)(W/V)蔗蔗糖糖 水溶液或水溶液或3030的甘油。的甘油。InsertEcoR1Xho11.9kb质粒质粒1 kb DNA Ladder1 kb DNA Ladder不能对不能对DNADNA质量进行精确定量分析，质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数进行比较估算出大概的数据。每条带大概的量如下据。每条带大概的量如下（按（按0.5g0.5g上样量计。应上样量计。应按按1212条带计算，因为条带计算，因为3kb3kb的的量是其它片段量的近三量是其它片段量的近三倍
19、）：倍）： 片段碱基对质量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*EcoR I 酶切位点：酶切位点：GAATT_CXho I 酶切位点：酶切位点：CTCGA_G1010H buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5)H buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5) 100mM MgCl 100mM MgCl2 2 10mM Dithiothreitol 10m
20、M Dithiothreitol 1000mM NaCl 1000mM NaCl酶活性的定义：酶活性的定义：一个活性单位（一个活性单位（U)U)，是指在，是指在5050 l l反应体系反应体系中，中，3737o oC C的条件下，经过的条件下，经过1 1小时的反应时间，小时的反应时间，将将1 1 g g DNA DNA 完全酶解所需要的酶量。完全酶解所需要的酶量。因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切或多
21、酶切时要考虑相容性缓冲液。双酶切或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公司会给用户提供这方面的液问题，一般公司会给用户提供这方面的信息。信息。电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等凝胶成像仪，一次性塑料手套等4. 实验方法和步骤实验方法和步骤 ll（ll） （ll）ll（ll* * 缓冲液随不同的酶而不同缓冲液随不同的酶而不同, ,本实验用本实验用 H bufferH buffer。置于置于3737水浴酶解水浴酶解0.5-10.5-1小时。酶解完成后，分小时。酶解完成后，分别加入别加入1010 l l 3 3倍的上样缓冲液倍的上样缓冲液, , 然后
22、各取然后各取1515 l l进进行电泳分析。行电泳分析。1) 质粒质粒DNA的酶解（自提质粒的酶解（自提质粒pCMV-Myc-T10）2) 琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶液的制备：称取琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8g琼脂糖，琼脂糖，置于三角瓶中，加入置于三角瓶中，加入100ml TBE或或TAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。3）胶板的制备）胶板的制备取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条条(宽约宽约1cm)，将有机玻璃内槽置于一，将有机玻璃内槽置于一
23、水平位置模具上，放好梳子。水平位置模具上，放好梳子。 将冷却至将冷却至65左右的琼脂糖凝胶液，小左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置室温下静置30min左右，待凝固完全后，左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有璃内槽放在含有0.5-1TAE（Tris-乙酸）乙酸） 或或T
24、BE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中硼酸）工作液的电泳槽中使用。使用。4）加样）加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约品孔容量约1520 l。1 kb DNA ladder（共（共10条带）条带）: 在第一在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入个上样孔或最后一个上样孔内加入6 l 的的 1 kb DNA ladder（50ng/ l ）。）。5）电泳
25、（带上手套操作）电泳（带上手套操作） 加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；加完样后的凝胶板即可通电进行电泳； 建议在建议在80100V的电压下电泳；的电压下电泳； 当溴酚兰移动到距离胶板下沿约当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处处停止电泳；停止电泳； 将凝胶放入将凝胶放入溴化乙啶（溴化乙啶（EB工作液工作液（0.5 g/ml左右）中染色约左右）中染色约20min。为了获得电泳分离为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨片段的最大分辨率，电场强度不应高于率，电场强度不应高于5V/cm（两电极（两电极间的距离）。电泳温度视需要而定，对间的距离）。电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室大
26、分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太稀，最好在时，由于胶太稀，最好在4进行进行电泳以增加凝胶硬度。电泳以增加凝胶硬度。6）观察与拍照）观察与拍照在紫外灯在紫外灯(310nm波长波长)下观察染色后的凝下观察染色后的凝胶。胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。存在处显示出红色的荧光条带。紫外光激发紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时，
27、遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。可采用快速凝胶成象系统。对于未进行酶切的质粒来说，常会出现两条对于未进行酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒DNADNA带，带，另一条是超螺旋状质粒另一条是超螺旋状质粒DNADNA的带，以超螺旋的带，以超螺旋状质粒状质粒DNADNA居多，移动速度也最快。有时还居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNADNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNADNA之间，之间，所以该条电泳带也位于上述两种带之间。如所以该条电泳带也位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。看不到。Relaxed circleLinearized formSuper-coiled form