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1、实验目的了解碱法提取质粒的原理;掌握碱法提取质粒的方法。第1页/共27页实验原理质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。第2页/共27页结构的三大要素:结构的三大要素:多克隆位点 选择标记(耐药性,LacZ)独立的复制单位种类:种类:质粒 噬菌体 酵母人工染色体(YAC)反转录病毒载体 表达载体等第3页/共27页第4页/共27页pBC SK mappBC SK map第5页/共27页T-载体第6页/共27页在碱性条件(pH 12.5
2、)下,线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性,质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕,紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时,染色体DNA分子难以复性,而质粒DNA分子很快复性,离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来,而质粒DNA则留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤,可得到较纯的质粒DNA。第7页/共27页实验仪器、材料与试剂(一)仪器 1.恒温摇床 2.超净工作台 3.高压灭菌锅 4.高速台式离心机 5.微量取液器 第8页/共27页第9页/共27页第10页/共27页第11页/共27页第12页/共27页第13页/共27页(二)材料 含pBC KS质粒的大肠杆菌 DH 5。含重组
3、质粒的大肠杆菌 DH 5。第14页/共27页(三)试剂 1.LB液体培养基(1L)胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml 搅拌,使溶质完全溶解,用NaOH调节pH值至7.0,加入去 离子水至总体积为1升,高压蒸汽灭菌20 分钟。LB固体培养基(1L)在上述LB液体培养基(1L)中加入琼脂粉15g。第15页/共27页2.Solution 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl(pH 8.0)10 mmol/L EDTA(pH 8.0)高压灭菌后,4保存备用。3.Solution(现用现配制)0.2 mol/L NaOH 1%SDS
4、 第16页/共27页4.Solution(100 ml)5mol/L KAc 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸 (pH 4.8)。5.氨苄青霉素(Amp)用无菌水配制成100 mg/ml 溶液,置-20冰箱保存备用。第17页/共27页6.胰RNA酶 将胰RNA酶(RNA 酶 A)溶于10 mmol/L Tris.Cl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中,配成10 mg/ml的浓度,于100加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20。7.氯仿,乙醇,70%乙醇。第18页/共27页实验步骤 质粒的提取
5、 1.用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培养基(含Amp 0.1 mg/ml)中,37振荡培养过夜。2.将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中,10,000 rpm离心1min,去掉上清液,重复两次。沉淀悬于200L SolutionI 中,涡旋使充分悬浮。3.加入300L SolutionII,混匀(注意动作轻),冰箱3 放置5min。4.加入300L SolutionIII,混匀(注意动作轻),冰箱3 放置5min。第19页/共27页5.12,000rpm,离心5min,将上清移至1个新Eppendorf 管中,注意所取体积(约600 L)。6.加入等体积氯仿(约600
6、L),混匀(注意动作轻)。12,000rpm,4,离心10min,取上清液。7.上清液中加入预冷的等体积异丙醇,-20沉淀 2030 min。8.12,000 rpm离心15 min。第20页/共27页9.去上清,沉淀加入500L 70%乙醇洗涤2次(12,000 rpm离心3分钟)。10.去掉上清(注意沉淀勿丢失),室温或真空干燥沉淀。11.每管中加入25L无菌水1L RNase,37溶解质粒DNA。第21页/共27页Biospin 质粒DNA 小量提取试剂盒(实际用)操作过程1.将11.5ml 过夜培养的细菌菌液加入1.5ml 离心管中。2.于10,000rpm离心30 秒,并弃去上清液。
7、如有需要,可多次重复步骤1、2,以收集更多细菌菌体。但勿过量,以免影响提取质粒的质量。3.加250l Resuspension Buffer,重悬细菌体沉淀。重悬后应该没有细菌团块。第22页/共27页4.加250l 细胞Lysis Buffer,轻柔颠倒46 次。不要剧烈振动,以防止基因组DNA 被剪切。注意不要让反应持续超过5 分钟。5.加350l Neutralization Buffer,立即轻柔颠倒离心管46 次。溶液应该出现絮状物,但不会出现局部沉淀。6.于13,000rpm离心10 分钟。如离心机转速不够可延长离心时间,直至形成紧密的白色沉淀。7.将步骤6 离心后得到的上清液转移到
8、Spin column 内。于6,000rpm离心1 分钟,并弃去接液管内液体。第23页/共27页8.向Spin column 内加650l Wash Buffer,于12,000g 离心3060 秒,并弃去接液管内液体。9.重复第8 步一次。10.再次于12,000rpm 离心1 分钟,然后将Spin column 转移到无菌的1.5ml 离心管中。如不进行该步离心,则无法保证离心柱内残液被彻底清除。11.向Spin column 内加20l Elution Buffer、去离子水或TE 溶液,并于室温静置1 分钟。可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。第24页/共27页12.于12,000rpm离心1 分钟,1.5ml 离心管内溶液中含有质粒DNA。13.提取的质粒DNA 可直接用于各类下游分子生物学实验,如果不立即使用,请保存于-20。第25页/共27页实验结果及讨论 碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一,提取量较大,便于操作。如有蛋白质残留,干燥后不透明,而呈白色。第26页/共27页感谢您的观看!第27页/共27页