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1、在制药业中，医药产业经历在制药业中，医药产业经历了了3 3 个不同的历史阶段个不同的历史阶段:1.1.天然药物天然药物2.2.通过化学方法合成的药通过化学方法合成的药物物3.3.基因工程药物基因工程药物第1页/共71页基因工程药物基因工程药物3 个阶段个阶段:其一是其一是细菌基因工程细菌基因工程，即把目的基因通过适当的改建导入大肠杆菌中即把目的基因通过适当的改建导入大肠杆菌中，再再通过细菌等原核微生物表达的目的蛋白作为药物通过细菌等原核微生物表达的目的蛋白作为药物;其二是其二是细胞基因工程药物细胞基因工程药物，这是把人或哺乳动物的基因直接导入哺乳动物这是把人或哺乳动物的基因直接导入哺乳动物的细
2、胞中的细胞中，生产有生物活性的产品生产有生物活性的产品;其三是其三是利用转基因动物生产低成本、高活性的药物利用转基因动物生产低成本、高活性的药物。第2页/共71页第一节第一节 基因工程药物概述基因工程药物概述第二节第二节 基因工程药物的表达基因工程药物的表达第三节第三节 基因工程药物的生产基因工程药物的生产第四节第四节 基因药物实例基因药物实例转基因动植物制药转基因动植物制药第3页/共71页发现和确证药物靶标设计新分子产生生物分子库新的生物分子下游工程生物药物制剂新的生物药物生物信息学基因组学功能基因组学蛋白质组学蛋白质工程分子结构和活性的关系蛋白质化学NMR，质谱X光晶体衍射代谢工程糖基化工
3、程天然配基新型生物药物研发流程第4页/共71页第一节第一节 基因工程药物概述基因工程药物概述意义：自2020世界7070年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获得的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。19821982年第一个基因重组产品人胰岛素在美国问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已有近3030种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经济效益。第5页/共71页（1）免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；（2）细胞因子，如各种干扰素、
4、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；（3）激素，如胰岛素、生长激素、心素纳；（4）酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。一、基因工程技术可生产的药物和制剂第6页/共71页二、基因工程技术生产药物的优点（1 1）利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽，为临床使用提供有效保障；（2 2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的使用范围；第7页/共71页（3 3）利用基因工程技术可以发现，挖掘更多的内源性生理活性物质；（4 4）内源生理活性物质在作为药物使用存放的不足之处，
5、可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；（5 5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。第8页/共71页三、我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差。1b 1b 型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年 通过 期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究开发中的也有10余种。第9页/共71页我国已批准上市的基因工程药物和疫苗我国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品名称产品名称适应症适应症开发及生产单位开发及生产单位批准时间批准时间重
6、组人干扰素重组人干扰素1b（外用）外用）病毒性角膜炎病毒性角膜炎长春生物制品研究所长春生物制品研究所1989年试生产年试生产重组人干扰素重组人干扰素1bHBV、HCV上海生物制品研究所等上海生物制品研究所等1996年年重组人干扰素重组人干扰素2a尖锐湿疣，疱疹尖锐湿疣，疱疹等，等，HBV、HCV新大洲药业等新大洲药业等1997年年重组人干扰素重组人干扰素2bHBV、HCV安徽安科生物工程股份安徽安科生物工程股份有限公司等有限公司等1997年试生产年试生产重组人干扰素重组人干扰素类风湿类风湿丽珠医药（集团）有限丽珠医药（集团）有限公司生物工程公司等公司生物工程公司等1995年试生产年试生产重组人
7、白介素重组人白介素2癌症辅助疗法癌症辅助疗法长春生物制品研究所等长春生物制品研究所等1997年试生产年试生产重组人巨噬细胞粒重组人巨噬细胞粒细胞集落刺激因子细胞集落刺激因子（GM-CSF）化疗生白细胞化疗生白细胞厦门特宝等厦门特宝等1997年试生产年试生产重组人粒细胞集落重组人粒细胞集落刺激因子刺激因子化疗生白细胞化疗生白细胞杭州九源基因公司等杭州九源基因公司等1996年试生产年试生产第10页/共71页我国已批准上市的基因工程药物和疫苗我国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品名称产品名称适应症适应症开发及生产单位开发及生产单位批准时间批准时间重组尿激酶重组尿激酶心肌梗死溶栓心肌梗死溶栓医大实业（
8、上海）医大实业（上海）1996年试生产年试生产重组人红细胞生成重组人红细胞生成素（素（EPO）再生障碍性贫血再生障碍性贫血南京华欣等南京华欣等1997年试生产年试生产重组人胰岛素重组人胰岛素糖尿病糖尿病通化安泰克通化安泰克1998年年重组人生长激素重组人生长激素儿童侏儒症儿童侏儒症长春金赛等长春金赛等1998年试生产年试生产重组碱性成纤维细重组碱性成纤维细胞生长因子胞生长因子创伤、烧伤创伤、烧伤珠海东大珠海东大1996年试生产年试生产乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗预防乙肝预防乙肝华北制药集团有限责任华北制药集团有限责任公司等公司等重组痢疾菌苗重组痢疾菌苗预防痢疾预防痢疾军事医学科学院军事医学科学院1
9、998年获新药证年获新药证书书重组表皮生长因子重组表皮生长因子创伤外用创伤外用中国医学科学院基础医中国医学科学院基础医学研究所学研究所2000年获新药证年获新药证书书第11页/共71页四、基因工程药物生产的基本过程定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达。第12页/共71页基因工程药物制造的一般流程：（1 1）获得目的基因；（2 2）组建重组质粒；（3 3）构建基因工程菌；（4 4）培养工程菌；（5 5）产物分离纯化；（6 6）除菌过滤；（7 7）半成品检定；（8 8）包装上
10、游阶段下游阶段第13页/共71页1 1、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。选择基因表达系统主要考便大量复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。其中的（多少和分离纯化的难易。其中的（1 1）、（）、（2 2）、）、（3 3）步骤属于上游阶段，在实验室完成。）步骤属于上
11、游阶段，在实验室完成。2 2、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度纯品的制备开发，分离纯化的优化控制，高纯度纯品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。上述（造，电子计算机的优化控制等。上述（4 4）、）、（5 5）、（）、（6 6）、（）、（7 7）、（）、（8 8）等属于下游
12、阶段。）等属于下游阶段。第14页/共71页第二节第二节 基因工程药物的表达基因工程药物的表达一、药物基因的分离二、基因表达第15页/共71页一、药物基因的分离一、药物基因的分离目前基因工程药物大都是人基因片段的蛋白产物，或糖基化修饰后的蛋白产物。真核生物的基因一般包括了若干外显子和内含子。由于内含子不能翻译产物，因此基因工程药物表达所使用的基因通常是cDNA，即mRNA的反转录产物。第16页/共71页特定的mRNA可以通过不同的方法获得。A.A.cDNAcDNA文库B.B.直接从特定的mRNAmRNA分离基因C.C.从蛋白质分离编码基因D.D.基因的化学合成E.E.RT-PCRRT-PCR分离
13、基因第17页/共71页1 1、mRNAmRNA的纯化2 2、cDNAcDNA第一链的合成3 3、cDNAcDNA第二链的合成4 4、cDNAcDNA克隆5 5、将重组体导入宿主细胞6 6、cDNAcDNA文库的鉴定7 7、目的cDNAcDNA克隆的分离和鉴定（一）（一）cDNAcDNA文库文库方法：oligo(DT)亲和层析法一般 mRNA都带有3polyA，所以可以用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。用放射性探针法检测。以cDNA第一链为模板合成第二链。（1）核酸探针杂交法（2）免疫反应鉴定法第18页/共71页用于cDNAcDNA克隆的载体有两类：质粒DNADNA和
14、噬菌体。又将其分为表达型载体和非表达型载体。选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。cDNAcDNA片段与载体的连接通常采用下面方法：a)a)加同聚尾连接：在载体和cDNAcDNA的3 3末端加上互补的同型多聚酶序列。b)b)人工接头连接：所谓人工接头是指用人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断。第19页/共71页前提：较小的蛋白质或多肽的编码基因，必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。限制：（二）化学合成法（二）化学合成法一、不能合成太长的基因。二、人工合成基因时，遗传密码的简
15、并会为选择密码子带来很大的困难。三、费用高第20页/共71页（三）RT-PCR逆转录聚合酶反应法。该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组，克隆。第21页/共71页二、基因表达二、基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片断，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。第22页/共71页基因工程重组药物宿主的选择主要考虑产物的活性表达和宿主的安全性。一般的原则是根据所用的载
16、体体系及各种受体细胞的基因型进行选择，要使重组体的转化或转染效率高、能稳定传代、受体细胞基因型与载体所含的选择标记需匹配。（一）宿主细胞的选（一）宿主细胞的选择择第23页/共71页1、原核细胞2、真核细胞（1 1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。（2 2）枯草芽孢杆菌（3 3）链霉菌（1 1）酵母：酿酒酵母应用广泛。（2 2）丝状真菌（3 3）哺乳动物细胞（4 4）植物细胞第24页/共71页（二）大肠杆菌中的基因表（二）大肠杆菌中的基因表达达1 1、载体表达载体必须具备的条件：（1 1）载体能够独立的复制（2 2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记（3 3）具有很强的启动子（4 4）具有
17、阻遏子（5 5）有很强的终止子（6 6）有翻译的起始信号第25页/共71页常用的表达载体：（1 1）pBV220pBV220系统（2 2）pETpET系统第26页/共71页2 2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素（1 1）外源基因的拷贝数（2 2）外源基因的表达效率（3 3）表达产物的稳定性（4 4）细胞的代谢负荷（5 5）工程菌的培养条件启动子的强弱核糖体结合位点SDSD序列和起始密码子ATGATG的间距密码子组成 第27页/共71页3 3、真核基因在大肠杆菌中的表达形式（1 1）以融合蛋白的表达形式表达药物基因由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质，称为融合蛋白。（2 2）以非融
18、合蛋白的形式表达药物基因（3 3）分泌型表达蛋白药物基因第28页/共71页1 1、载体（1 1）载体的复制序列包括YEpYEp类、YRpYRp类、YRpYRp类和YIpYIp类。（2 2）克隆载体由于从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易，所以酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的。（3 3）表达载体包括普通表达载体和精确表达载体。（三）酵母中的基因表达（三）酵母中的基因表达第29页/共71页2 2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素（1 1）外源基因的拷贝数（2 2）外源基因的表达效率（3 3）外源蛋白的糖基化（4 4）宿主菌株的影响表达用的酵母宿主菌应具备：菌体生长力强。菌体内蛋白酶要较
19、弱。菌株性能稳定。分泌能力强。主要与启动子、分泌信号和终止序列有关。第30页/共71页（四）动物细胞中的基因表达（四）动物细胞中的基因表达v中国仓鼠卵巢细胞（CHO）v猴肾细胞（COS）CHO细胞属成纤维细胞，该细胞缺乏二氢叶酸还原酶（DHFR），经转染可将DHFR重组至细胞中，含有DHFR表达载体的重组CHO细胞，经氨甲喋呤（MTX）培养筛选后可选择出克隆表达异源基因的重组细胞。哺乳动物细胞表达外源基因的主要优点能识别和剪切外源基因中的内含子并加工为成熟的mRNAmRNA。第31页/共71页主要载体vSV40衍生载体v逆转录病毒载体v腺病毒载体（AV）v腺相关病毒载体（AVV）v痘苗病毒载体
20、（VV）第32页/共71页三、基因工程菌的稳定三、基因工程菌的稳定性性基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，又分为分裂不稳定和结构不稳定。分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。第33页/共71页质粒稳定性的分析方法：1 1、质粒不稳定产生的原因主要与两个因素有关：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；二是这两种菌的生长比速率差异的大小。第34页/共71页二阶段培养法：第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。2 2、提高质粒稳定性的方法第35页/共71页第三节第三节 基因工
21、程药物的生产基因工程药物的生产第36页/共71页一、基因工程药物的生产特点是外源蛋白在宿主细胞内的异源表达，不同于微生是外源蛋白在宿主细胞内的异源表达，不同于微生物的天然次级代谢药物，因此在调控合成方式上，物的天然次级代谢药物，因此在调控合成方式上，应该主要受限于质粒或噬菌体的内在性质；应该主要受限于质粒或噬菌体的内在性质；是蛋白质产物，不同于种类多样的次级代谢产物；是蛋白质产物，不同于种类多样的次级代谢产物；合成途径简单，没有复杂的多酶系统；合成途径简单，没有复杂的多酶系统；产物的积累主要在胞内，分泌型也主要积累在细胞产物的积累主要在胞内，分泌型也主要积累在细胞周质中；周质中；产物在胞内积累
22、通常是以内涵体的形式；产物在胞内积累通常是以内涵体的形式；分离纯化相对于次级代谢产物而言要简单、一致；分离纯化相对于次级代谢产物而言要简单、一致；产物分离纯化后可能没有活性，需要进一步的复性。产物分离纯化后可能没有活性，需要进一步的复性。第37页/共71页基因工程药物是转基因产品，具有潜在的危险，因此对产生菌的管理要求严格，应该避免各种可能的扩散污染，必须在合格的GMP生产车间进行。基因工程药物的GMP是对生产全过程的质量管理，涉及人员、厂房、设备，原材料采购入库、检验、发料、加工、制品及半成品检验、分包装，成品检定，产品销售、运输，用户意见及使用反应处理等在内的全过程的质量管理。第38页/共
23、71页二、基因工程菌发酵基因工程菌的培养过程主要包括：（1）通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分拆表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；（2）通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。第39页/共71页1、基因工程菌的培养方式常用的有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养。第40页/共71页（1 1）补料分批培养将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。（2）连续培养将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。（3）
24、透析培养利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。（4）固定化培养第41页/共71页2、基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别：（1）生物材料方面（2）生产目的方面第42页/共71页（1）培养基的影响常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。第43页/共71页（2）接种量的影响接种量是指移入的种子液体和培养液体积的比例。接种量小，不利
25、于外源基因的表达，大接种量有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。所以接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。第44页/共71页（3）温度的影响温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上。在复制水平上，可通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达；在转录水平上，可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达；温度也可在mRNA讲解和翻译水平上影响基因表达，温度还可能通过细胞内小分子调节分子的量而影响基因表达，也可通过影响细胞内ppGpp量调控一系列基因表。温
26、度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。第45页/共71页（4）溶解氧的影响溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。第46页/共71页（5）诱导时机的影响一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。第47页/共71页总之，工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建立最佳优化工艺。（6）pH的影响pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。第48页/共71页3
27、、基因工程菌的培养设备发酵罐的组成部分有：发酵罐体保证高传质作用的搅拌器精细的温度控制灭菌系统空气无菌过滤装置残留气体处理装置参数测量与控制系统培养液配置连续操作装置等。第49页/共71页三、基因工程药物的分离纯化三、基因工程药物的分离纯化许多医药生物技术产品都是活性肽或蛋白质。这些产品的制得具有下列特点：（1）目的产物在初始物料中含量较低（2）含目的产物的初始物料组成复杂，且影响较大（3）目的产物的稳定性差（4）种类繁多（5）应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原等。因此，为了获得合格的目的产物，必须建立与上述特点相适应的医药生物技术产品的分离纯化工艺。第50页/共71页（一）
28、建立分离纯化工艺的依据1、含目的产物的起始物料的特点：（1）菌种类型及其代谢特性（2）原材料和培养基的来源及其质量（3）生产工艺和条件（4）初始物料的物理、化学和生物学特性。2、物料中杂质的种类和性质3、目的产物特性4、产品质量的要求第51页/共71页（二）分离纯化的基本过程分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环。一般不应超过45个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。第52页/共71页（三）分离纯化的技术分离纯化技术应满足下列要求：（1）技术条件要温和（2）选择性要好（3）收率要高（4）两个技术之间要能直接衔接（5）整个分离纯化过程要快第53页/
29、共71页1、细胞破碎与固液分离（1）细胞收集：细胞收集常用的是离心分离的方法，膜过滤法液逐步得到广泛应用。（2）细胞破碎：有机械破碎法和非机械破碎法。机械破碎法：高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压法非机械破碎法：酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法等。（3）固液分离：离心沉淀是固液分离的主要手段，包括高速离心和超速离心。常用的膜过滤技术有微滤、超滤和反渗透等。第54页/共71页2、目的产物的分离纯化主要依赖色谱分离方法。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶色谱、高压液相色谱等。蛋白质纯化方法的设计通常根据产物分子的物理、化学参数和生物学特性。选择纯化方法
30、应根据目的蛋白质和杂蛋白的物理、化学和生物学方面性质的差异，尤其重要的是表面性质的差异。第55页/共71页（1）离子交换色谱（ion exchange chromatography,IEC）基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。蛋白质的等电点和表面电荷的分布主要影响其离子交换的性能，影响蛋白质离子交换色谱保留的其他因素，还有交换基团和交换介质的种类、吸附和洗脱的条件等。第56页/共71页（2）反相色谱（reversed phase chromatography,RPC）和疏水色谱（hydrophobic interaction chromatogr
31、aphy,HIC）反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。第57页/共71页（3）亲和色谱（affinity chromatography,AC）亲和色谱是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附的。亲和色谱的过程大致分为3步：1)配基固定化;2)吸附目的产物；3)样品解吸。第58页/共71页（4）凝胶过滤色谱凝胶过滤是以具有空隙大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。第59页/共71页3、非蛋白质类杂质的去除非蛋白质类杂质不应忽视，在纯化过程中，需特别注意3种可能
32、存在的非蛋白类杂质，它们是DNA、热原质和病毒。第60页/共71页（四）选择分离纯化方法的依据1、根据产物表达形式来选择2、根据分离单元之间的衔接选择3、根据分离纯化工艺的要求来选择第61页/共71页四、基因工程药物的质量控制四、基因工程药物的质量控制1、原材料的质量控制原材料的质量控制是要确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。第62页/共71页2、培养过程的质量控制在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。第63页/
33、共71页3、纯化工艺过程的质量控制产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致；外源性蛋白质、DNA与热原都控制在规定限度下。第64页/共71页4、目标产品的质量控制基因工程药物质量控制主要包括以下几项要求：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。第65页/共71页（1）产品的鉴别1）肽图分析：肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进行分离分析。肽图分析结果与氨基酸成分和序列分析结果合并，作为蛋白质的精确鉴别。2）氨基酸成分分析：对目的产物的纯度仍可以提供重要信息。3）部分氨基酸序列分析：可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。4）重组蛋白质的浓度测定和相
34、对分子质量测定：浓度测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林酚法和紫外光谱法等。相对分子质量测定最常用的方法有凝胶过滤法和SDSPAGE法，凝胶过滤法是测定完整的蛋白质相对分子质量，而SDSPAGE法测定的是蛋白质亚基的相对分子质量。5）蛋白质二硫键分析：方法有对氯汞苯甲酸法（p-chloromercuribenzoate,PCMB）和5,5二硫双基2硝基苯甲酸法（5,5dithiobis2nitrobenzoic acid,DTNB）等。第66页/共71页（2）纯度分析纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目，它包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析两个方面的内容。1）目的蛋白
35、质含量测定：通常采用的方法有还原性及非还原性SDSPAGE法、等电点聚焦、各种HLPC、毛细管电泳（CE）等。2）杂质第67页/共71页A、蛋白类杂质：主要的是纯化过程中残余的宿主细蛋白。它的测定基本上是采用免疫分析的方法，其灵敏度可达百万分之一。同时需辅以电泳等其他检测手段对其加以补充和验证。其他的蛋白杂质也要严格控制。B、非蛋白质类杂质：主要有病毒和细菌等微生物、热原、热原质、内毒素、致敏原及DNA。第68页/共71页（3）生物活性测定需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。（4）稳定性考察（5）产品一致性的保证第69页/共71页5、产品的保存（1）液态保存低温保存在稳定pH条件下保存高浓度保存加保护剂保存（2）固态保存第70页/共71页谢谢您的观看！第71页/共71页