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1、 第三章第三章 基因工程制药基因工程制药基因工程的基础知识基因工程的基础知识 第一节 基因的概念与特性 一、基因的概念:DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。早期认为遗传物质是蛋白质，1944年Avery从肺炎链球菌转化实验证明是DNA。AA：SS有夹膜致病菌，有夹膜致病菌，BB：RR突变非致病菌，突变非致病菌，CC：加热杀死：加热杀死SS菌，菌，DD：活：活RR死死SS二、基因的一般特性：基因可自我复制，基因决定蛋白质结构，基因可突变。基因按功能分为：结构基因调控基因第二节第二节 DNA DNA的复制与表达的复制与表达一、一、DNADNA的复制：的复制：半保
2、留复制半保留复制 二、基因表达 转录：在转录：在RNARNA聚合酶的催化下以聚合酶的催化下以DNADNA为模板合成为模板合成mRNAmRNA的过程。的过程。转录后加工：转录后加工：剪切：除去内含子剪切：除去内含子 加帽：加帽：55加加m7Gpppm7Gppp 加尾：加尾：33加加polypoly（AA）二、二、翻译：以翻译：以mRNAmRNA为模板为模板,tRNA,tRNA作为作为运载工具运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程合成蛋白质的过程。分为三个阶段：分为三个阶段：起始起始 延长延长 止止真核细胞的翻译过程真核细胞的翻译过程翻译后的肽链加工翻译后的肽链
3、加工肽链切断肽链切断羟基化羟基化糖基化糖基化磷酸化磷酸化乙酰化乙酰化第一节第一节 概概 述述 20 20世纪世纪7070年代基因工程诞生最年代基因工程诞生最先应用在医药科学领域。先应用在医药科学领域。1982 1982年第一个基因工程产品年第一个基因工程产品-人胰岛素在美国问世。人胰岛素在美国问世。优点优点:大量生产、应用临床、大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足深入研究、扩大应用、改造不足。基因工程基本过程 基因工程基本过程基因工程基本过程 基因工程药物制药的主要程序基因工程药物制药的主要程序:目的基因的克隆，目的基因的克隆，构建构建DANDAN重组体，重组体，DANDAN重组体
4、转入宿主菌，重组体转入宿主菌，构建工程菌，构建工程菌，工程菌发酵，工程菌发酵，表达产物的分离纯化，表达产物的分离纯化，产品的检验等。产品的检验等。第三节第三节 目的基因的获得目的基因的获得 克隆真核基因常用方法：逆转录法克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。和化学合成法。一、逆转录法一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因逆转录法就是先分离纯化目的基因的的 mRNA mRNA，在反转录成，在反转录成 cDNA cDNA，然后进，然后进行行 cDNA cDNA 的克隆表达。的克隆表达。mRNA mRNA的纯化的纯化 cDNA cDNA第一链的合成第一链的合成 cDNA cDNA第二链的
5、合成第二链的合成 cDNA cDNA的克隆的克隆 将重组体导入宿主细胞将重组体导入宿主细胞 cDNA cDNA文库的鉴定文库的鉴定 目的目的cDNAcDNA克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定 二、化学合成法二、化学合成法 较小的蛋白质或多肽的编码基较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。因可以用化学合成法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。序或目的蛋白质的氨基酸顺序。用化学法合成目的基因用化学法合成目的基因DNADNA不同不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的再退火成为两端形成粘性末端的DNADNA双链片段，然后将这些双链双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连片段按正确的次序进行退火使连接成较长的接成较长的DNADNA片段，再用连接片段，再用连接酶连接成完整的基因。酶连接成完整的基因。人工化学合成基因的限制有：人工化学合成基因的限制有：不能合成太长的基因。目前不能合成太长的基因。目前 DNA DNA 合成仪所合成的寡核苷酸片段仅合成仪所合成的寡核苷酸片段仅为为 50 50 60 bp 60 bp，因此，因此 只适用于克隆小分子肽的基因。只适用于克隆小分子肽的基因。