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1、作业作业 查阅资料，准备查阅资料，准备pptppt、课程论文介绍、课程论文介绍某种基因工程药物的生产工艺。某种基因工程药物的生产工艺。第1页/共163页一、基因工程药物 1982年第一个基因重组产品人胰岛素在美国Eli Lilly公司问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已有近30种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经济效益。第2页/共163页基因工程技术可生产的药物和制剂包括：（1）免疫性蛋白：如各种抗原和单克隆抗体；（2）细胞因子：如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；（3）激素：如胰岛素、生长激素、心素纳；（4）酶类：如尿
2、激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。第3页/共163页 主要基因工程产品的研制、开发、上市时间主要基因工程产品的研制、开发、上市时间产品产品时间时间国家国家用途用途上市上市时间时间国家国家人生长激素释放抑制素人生长激素释放抑制素(SRM)(SRM)19771977日本日本巨人症巨人症人胰岛素（人胰岛素（Insulin Insulin）19781978美国美国糖尿病糖尿病19821982欧洲欧洲人生长激素（人生长激素（HGHHGH）19791979美国美国侏儒症侏儒症19851985美国美国人人-干扰素（干扰素（IFNI
3、FN）19801980美国美国病毒病毒19851985欧洲欧洲乙肝疫苗（乙肝疫苗（HBsAgVHBsAgV）19831983美国美国乙肝乙肝19861986欧洲欧洲人白细胞介素（人白细胞介素（HILHIL）19841984美国美国肿瘤肿瘤19891989欧洲欧洲人促红细胞生成素（人促红细胞生成素（EPOEPO）日本日本贫血贫血19881988欧洲欧洲人粒细胞集落刺激因子人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(G-CSF)白血病白血病19911991美国美国人组织纤溶酶原激活剂（人组织纤溶酶原激活剂（t-PAt-PA）血栓症血栓症1987 1987 美国美国第4页/共163页美国已批准了56种生物制
4、剂部分摘录（1）产品 公司 主要适应症-人胰岛素Eil Lilly 糖尿病人生长激素 Eil Lilly 儿童生长激素缺乏症&2a干扰素 Hoffmann-La Rocke 白血病a-2b干扰素 Schering-Plough 白血病、爱滋病、肝炎小鼠抗CO3单抗Ortho Biotech 肾、心移植排斥反应乙肝疫苗MSDMerck 乙型肝炎t-pA（altepl-ase）Genentech 急性心肌梗死、肺栓塞B型嗜血性流感疫苗 Praxis Biologics B型嗜血性流感第5页/共163页美国已批准了56种生物制剂部分摘录（2）产品 公司 主要适应症-EPO Ortho Biotech
5、慢性肾衰竭贫血a-n3干扰素Interferon Sciences 性疣r-1b干扰素Genentech 类风湿rG-CSFAmgen 化疗所致的白细胞减少GM-CSFImmunex 自体骨髓移植白细胞介素-2Chiron 转移性肾癌凝血因子VII Genetics Institute 血友病第6页/共163页美国已批准了56种生物制剂部分摘录（3）产品 公司 主要适应症-1b干扰素 Berlex Lab Chiron 多发性硬皮病-葡萄糖苷脂酸Genzyme Gaucher遗传病单抗治疗剂 Centocor 抗血液凝固因子VIIINovo 血友病HumalogLilly 糖尿病Natepla
6、se三井-持田 溶血栓alfacon-1干扰素Amgen 慢性丙肝干扰素8-nlOtsuka（日本）治疗蕈样真菌病第7页/共163页基因工程技术生产药物的优点：（1）利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽，为临床使用提供有效保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的引用范围；（3）利用基因工程技术可以发现，挖掘更多的内源性生理活性物质；（4）内源生理活性物质在作为药物使用存放的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去;（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。第8页/共163页我国基因工
7、程药物研究和开发：起步较晚，基础较差。1b 型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年 通过 期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究开发中的也有10余种。第9页/共163页2006年4月前我国批准上市的35种生物技术药物批准年份批准年份药品药品批准年份批准年份药品药品1989干扰素干扰素IFN-1b1999125Ala IL-2人胰岛素人胰岛素Anti-CD3鼠源单抗鼠源单抗1992IFN-2a2000人碱性成纤维细胞生长因子（人碱性成纤维细胞生长
8、因子（bFGFbFGF）表皮生长因子（表皮生长因子（EGFEGF）EGFEGF衍生物衍生物霍乱疫苗（霍乱疫苗（rBS-WCrBS-WC）1994白介素白介素2（IL-2）2001抗抗IL-8鼠源单抗凝乳剂鼠源单抗凝乳剂1995乙肝疫苗（酵母）乙肝疫苗（酵母）2003IL-11肿瘤细胞细胞核嵌合抗体注射液肿瘤细胞细胞核嵌合抗体注射液131I重组葡激酶（重组葡激酶（r-SAK）1996IFN-2b，乙肝疫苗（乙肝疫苗（CHO）粒细胞集落刺激因子（粒细胞集落刺激因子（G-CSF）2004重组人重组人p53腺病毒注射液腺病毒注射液抗抗EGFR人源单抗人源单抗1997粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（粒细胞巨
9、噬细胞集落刺激因子（G-CSF）重组链激酶（重组链激酶（-SK）促红细胞生成素（促红细胞生成素（EPO）2005重组人脑利钠肽重组人脑利钠肽重组人血管内皮抑素重组人血管内皮抑素重组人重组人5型腺病毒注射液（型腺病毒注射液（H101）重组人肿瘤坏死因子重组人肿瘤坏死因子（rhTNF）重组人血小板生成素（重组人血小板生成素（rhEPO）1998IFN-125Ser IL-2125Ser IL-2生长激素（生长激素（GHGH）痢疾疫苗痢疾疫苗牛碱性成纤维细胞生长因子（牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGFbFGF）2006重组重组TNFR-Fc融合蛋白融合蛋白第10页/共163页第11页/共163页基因
10、工程（genetic engineering）：也称基因操作、遗传工程，重组体DNA技术，基因克隆或分子克隆，指将不同生物的遗传物质基因，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体（质粒、噬菌体或病毒等）转入微生物、植物或动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。第12页/共163页供体细胞载体分子外源DNA外源基因分离酶切酶切连接转化扩增DNA重组分子受体细胞鉴定与表达重组转化子工程菌或细胞蛋白产物工程菌或细胞培养重组产物分离纯化第13页/共163页 目的基因目的基因 基因载体基因载体重组体重组体分切接转筛表总体技术
11、路线第14页/共163页基因工程的操作流程1、分、分：分离目的基因分离目的基因2、切、切：对目的基因和载体适当切：对目的基因和载体适当切割割3、接、接：目的基因与载体连接：目的基因与载体连接4、转、转：重组：重组DNA转入受体细胞转入受体细胞5、筛、筛：筛选出含有重组体的受体：筛选出含有重组体的受体细胞细胞6、表、表：目的基因在受体细胞中表：目的基因在受体细胞中表达，受体细胞成长为基因改达，受体细胞成长为基因改造生物造生物第15页/共163页基因工程制药的基本过程获得目的基因构建重组质粒组建基因工程菌或者基因工程细胞工程菌培养产物分离纯化基因工程药物的质量控制第16页/共163页第17页/共1
12、63页目的基因的获得一、酶切法直接分离目的基因二、PCR直接扩增目的基因三、文库法分离目的基因四、化学合成目的基因第18页/共163页酶切法直接分离目的基因第19页/共163页plasmid DNAGenomic DNA第20页/共163页gagctcaagctt第21页/共163页限制性内切酶在DNA克隆中的应用第22页/共163页PCRPolymerase chain reaction聚合酶链式反应第23页/共163页PCRPCRPCRPCR的基本原理的基本原理1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上
13、DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链第24页/共163页模板DNA95第25页/共163页PCRPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点55引物1引物2DNA引物第26页/共163页PCRPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第27页/共163页PCRPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95第2轮开始第28页/共163页PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点55TaqTaqTaqTaq第29页/共163页PCRPCR的基本原理PCR反应
14、条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束第30页/共163页PCRPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增第31页/共163页 PCR PCR 动画动画1 1stst cycle cycle2 2ndnd cycle cycle3 3rdrd cycle cycle过过 程程变变 性性引引 物物 退退 火火DNA DNA 复制复制第32页/共163页PCRPCR琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳最终产物最终产物最终产物最终产物紫外光观察紫外光观察紫外光观察紫外光观察3-4 3-4 3-4 3
15、-4 小时小时小时小时第33页/共163页片段化、分级分离片段化、分级分离基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装第34页/共163页第35页/共163页化学合成目的基因第36页/共163页什么什么是载体？是载体？载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。载体概述载体概述第37页/共163页多克隆位点ori复制起始点遗传标记A Ammp ppolylinker基因载体载体概述载体概述第38页/共163页三个显著特点：（1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。（2
16、）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因Lac Z，可利用-互补原理进行蓝白斑筛选。（3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。质粒载体第39页/共163页连接第40页/共163页转化受体细胞第41页/共163页1 1、抗药性检测筛选法第42页/共163页2 2、显色检测IPTG：异丙基硫代半乳糖苷 诱导物X-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷第43页/共163页3 3、限制酶切图谱检测第44页/共163页4 4、PCRPCR扩增检测用PCR的方法检测是否插入外源基因片段。优点：不需要合适的酶切位点。缺点：假阳性高。第45页/共163页5 5、原位杂交检测根据插入D
17、NA片段的序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据 第46页/共163页6、序列测定双脱氧测序第47页/共163页第48页/共163页双脱氧末端终止测序法的基本反应：双脱氧末端终止测序法的基本反应：GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACAGGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA第49页/共163页双脱氧末端终止测序法双脱氧末端终止测序法 Sanger双脱氧终止法测序过程第50页/共163页第51页/共163页模板序列第52页/共163页测序读片第53页/共163页 近年来，建立了一种使用荧光染料的无放
18、射性标记的DNA测序法。它使用4种不同颜色的荧光染料分别标记4种不同的碱基，并在一个凝胶电泳的泳道中进行电泳，然后通过激光作用诱发荧光，达到检测碱基的目的。激光检测器把收集到的信息传到电脑，计算机会自动显示或打印出碱基顺序。这样一个泳道一次电泳可读出450左右个碱基，一块凝胶36个泳道可测36450约16200个碱基，大大加快了测序的速度。后来又发明了一种用毛细管电泳代替凝胶电泳的方法，可大大加快电泳的速度分辨率，并可实现自动灌胶和自动进样。第54页/共163页测序结果第55页/共163页7 7、外源蛋白质检测利用插入DNA所表达的蛋白质的功能或者结构性质，检测外源蛋白质的存在。适用于表达载体
19、的检测。第56页/共163页受体细胞选择 外源基因在大肠杆菌、枯草芽外源基因在大肠杆菌、枯草芽外源基因在大肠杆菌、枯草芽外源基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌细胞中的表达孢杆菌细胞中的表达孢杆菌细胞中的表达孢杆菌细胞中的表达 外源基因在病毒中的表达外源基因在病毒中的表达外源基因在病毒中的表达外源基因在病毒中的表达 外源基因在酵母细胞中的表达外源基因在酵母细胞中的表达外源基因在酵母细胞中的表达外源基因在酵母细胞中的表达 外源基因在昆虫细胞中的表达外源基因在昆虫细胞中的表达外源基因在昆虫细胞中的表达外源基因在昆虫细胞中的表达 外源基因在植物细胞中的表达外源基因在植物细胞中的表达外源基因在植物细胞中的表达
20、外源基因在植物细胞中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的外源基因在哺乳动物细胞中的外源基因在哺乳动物细胞中的外源基因在哺乳动物细胞中的表达表达表达表达第57页/共163页1、大肠杆菌表达系统大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。第58页/共163页第59页/共163页2、枯草杆菌表达系统枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。优点：1.枯草杆菌具有胞外酶分泌调节基因，能将具有表达的产物高
21、效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。2.枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。3.枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。4.枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。应用：已成功的用于表达人的干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。第60页/共163页 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸
22、露结构，这它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为种水不溶性的结构称为包涵体（包涵体（Inclusion BodiesInclusion Bodies，IBIB）。如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%20%以上时，表以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达基因操作的关键就是选
23、择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在。率也是包涵体法的长处所在。在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于程，因此永远成为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和这两种状态，因此需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作。驱散集聚体）复性操作。包涵体表达包涵体表达第61页/共163页 融合型表达 将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开将外源基因与受体菌自身的蛋白质
24、编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达放型阅读框架进行表达,由这种杂合基因表达出的蛋白质称为由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于通常受体细菌的蛋白部分位于N N N N端，异源蛋白位端，异源蛋白位于于C C C C端。通过在端。通过在DNADNADNADNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。N末端：由原核基因编码一
25、段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。质粒基因产物 目的基因产物NC切割第62页/共163页第63页/共163页常用的受体蛋白（原核细菌表达的蛋白质）第64页/共163页（D3）受体蛋白的切除方法v化学断裂法：溴化氰（CNBr）-Met-（切点）-AAv酶促断裂法：凝血因子Xa，有蛋白酶活性，识别序列:IleGluGlyArg-（切点）-AA第65页/共163页第66页/共163页分泌表达蛋白 细胞质外膜内膜周间质质粒染色体“外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。第67页/共163页分泌蛋白表达的原理图示第68页/共163页常用的大肠杆菌信号肽
26、碱性磷酸酶信号肽（phoA）膜外周质蛋白质信号肽（OmpA）霍乱弧菌毒素B亚单位（CTXB）。第69页/共163页酵母表达系统第70页/共163页能提高重组异源蛋白产率的诱变酵母菌第71页/共163页基因工程细胞的扩增和发酵生产（一）基因工程菌的稳定性（二）基因工程菌培养的程序（三）基因工程菌的培养方式（四）影响基因工程菌培养的各种因素分析（五）基因工程菌的培养设备-生物反应器第72页/共163页1、基因工程菌质粒的不稳定性基因工程菌质粒不稳定与2个因素有关：（1）分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。（2）结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失而导致工程菌
27、性能的改变。由于丢失质粒的细菌要比含有质粒的工程菌更具有生长优质，因此在竞争中最后会取代工程菌，而演变成为优势菌。最后导致蛋白质表达量的减少。第73页/共163页2、质粒稳定性的分析方法（1）将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂于不含抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出的菌落数A；（2）然后随机挑选100个菌落，接种到含有抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出的菌落数B；（3）计算出B/A的比值。该比值能够反映出质粒的稳定性。因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养基环境中是不能正常生长的。第74页/共163页3、质粒不稳定的原因1、分裂不稳定-是指基因工程菌在
28、分裂的子代菌体中，出现一定比例不含质粒的现象。它主要与2个因素有关：（1）工程菌产生丢失质粒的概率，拷贝量低的工程细菌，它所产生不含质粒的细菌变异株和概率较大。（2）丢失质粒的细菌、含有质粒的工程菌之间的竞争力大小。2、结构不稳定-是指外源基因从质粒上丢失、或者发生碱基后果排、缺失现象，最终导致工程菌性能改变的现象。第75页/共163页4、提高质粒稳定性的方法（1）、分阶段培养法（2）、在培养基中加入抗生素，形成选择性压力（3）、通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施第76页/共163页（1）、分阶段培养法工程菌的培养一般分为2个阶段：（1）第一阶段-先使菌体生长至一定密度。（2）
29、第二阶段-开始诱导外源基因的表达。由于第一阶段外源基因没有表达，减少了丢失质粒的细菌的产生概率，也就增加了工程菌的稳定性。第77页/共163页（2）、培养基中加入抗生素，形成选择性压力因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养基环境中是不能正常生长的。所以可以通过加入抗生素来抑制质粒丢失的细菌的生长。第78页/共163页（3）、通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施通过以下方法可以提高质粒的稳定性。（1）间歇送氧（2）改变稀释速率第79页/共163页（二）基因工程菌培养的程序1、摇瓶操作-通过摇瓶操作，来子解工程菌生长的基础条件，如温度值、培养基的组分、氮碳比、表达产物的积累对于工程细胞
30、的影响。2、培养罐操作-通过培养罐操作，来确定培养参数、确定培养方案、以及确定培养顺序。第80页/共163页（三）基因工程菌的培养方式1、补料分批培养2、连续培养3、透析培养4、固定化培养5、高密度培养第81页/共163页1、补料分批培养是指将种子接入发酵反应器进行培养，经过一段时间之后，间歇式地、或者连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。其目的是为了创造一个良好的微生物环境，延长菌体的对数生长期，来获得高密度的菌体总量。第82页/共163页2、连续培养将种子接入发酵反应器中，搅拌式培养达到一定的菌体浓度之后，同时进行进料、出料的操作，通过控制一定的营养物稀释比率，来进行不间断式培养的
31、方式，称为连续培养。连续培养有利于保持生产环境的恒定，有利于控制菌体的生长速率。但是由于基因工程菌的不稳定性，导致连续培养比较困难。第83页/共163页3、透析培养透析培养是利用膜的半透性原理，使得代谢产物和培养基分开，通过去除培养液中的借调产物的方法来消除代谢产物对工程菌的不良影响。透析装置是用半透膜将发酵器隔成二半，形成发酵液区、和透析液区，通过透析来及时移去合成产物。半透膜的种类、孔径、面积、发酵液和透析液的比例、透析液的组成、循环流速、培养持续时间等等因素会影响产物的得率。用透析法培养大肠杆菌E.coliHB101（pPKAS2）生产青霉素酰化霉，其产率可以提高11倍。第84页/共16
32、3页4、固定化培养为了维持质粒的稳定性，人们将固定化技术和基因工程菌结合起来，进行固定化式连续培养，有利于提高生产效率。第85页/共163页高密度培养技术又称高密度发酵技术，指提高基因工程菌菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率，即单位体积单位时间内产物的产量。优点：不仅可以减少培养体积、强化下游分离提纯，而且可以缩短生产周期，减少设备投资，从而降低生产成本。第86页/共163页大肠杆菌高密度培养技术大肠杆菌高密度发酵理论最大值为400g DCW/L（DCW：dry cell weight），相对于发酵液中25%是大肠杆菌细胞。迄今为止，最高密度发酵的两个例子是非重组菌E.coli W3110
33、（密度为174 g DCW/L）；生产聚-3-羟基丁酸的重组菌（密度为175.4 g DCW/L）第87页/共163页影响大肠杆菌高密度发酵的因素发酵培养基：碳氮比；碳源氮源浓度表达基因的调控宿主菌质粒拷贝数和稳定性诱导时间和诱导强度大肠杆菌高密度发酵的补料调控：恒速流加补料、变速流加补料和指数流加补料乙酸对生长和表达的影响：减少乙酸第88页/共163页酵母菌高密度培养技术大肠杆菌高密度发酵理论最大值为280g DCW/L（DCW：dry cell weight），目前发酵过程中，一般认为酵母密度为100200 g DCW/L即为高密度发酵。常用高密度发酵宿主菌是巴氏毕赤酵母第89页/共163
34、页毕赤酵母高密度培养技术首先用含甘油的合成培养基培养，外源基因的表达被完全抑制。当甘油消耗完，开始流加甘油至培养物种，使细胞限速生长。最后流加甲醇或甲醇与甘油混合物，诱导外源基因表达，同时检测培养液中的外源蛋白浓度，到适当水平停止发酵和收获目的蛋白。第90页/共163页实例：表达重组人血清白蛋白（rHSA）毕赤酵母工程菌高密度培养在15L多参数全自动发酵罐中，OD600达500700，密度达115160g DCW/L，rHSA蛋白表达量达3.6g/L。工艺：22h分批发酵结束后，开始流加补料发酵培养基，通过控制流加速率，以控制溶氧浓度（DO）在20%以上。在46h达到OD值700，达到高密度，
35、停止流加。当DO陡然上升到70%，开始流加诱导表达培养基，通过控制流加速率，以控制溶氧浓度（DO）在20%以上。在120h，rHSA表达量最大达到3.6g/L。第91页/共163页（四）影响基因工程菌培养的各种因素分析 基因工程菌传统微生物生物材料含外源重组基因 不含外源重组基因发酵工艺使外源基因高效表达 使自身基因表达目的产生外源蛋白质 产生自身的代谢产物1、培养基的影响2、接种量的影响3、温度的影响4、溶解氧的影响5、诱导时机的影响6、PH值的影响第92页/共163页1、培养基的影响（1）常用的碳源有：葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。（2）常用的氮源有：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆
36、、制定水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵。（3）其它组成成份：无机盐、微量元素、维生素、生物素。（4）无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子。第93页/共163页2、接种量的影响接种量是指所移入的种子液体量与培养液体量的比例，它的大小会影响发酵物的产量和发酵周期。（1）接种量小，菌体生长延迟，不利于外源基因的表达。（2）接种量适中，生产菌能够迅速占领整个培养环境，减少菌体污染的机会。（3）接种量过大，菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。一般来说，10-15%的接种量，菌体的延迟期短、菌群迅速繁衍、很快进入对数生长期，适用于个源基因的表达。第94页/共163页3、温度的影响
37、温度对基因表达的调控作用发生在复制、转录、翻译、小分子蛋白质的合成水平等方面。（1）在复制水平，温度可影响基因拷贝数量。（2）在转录水平，温度可影响RNA聚合酶的作用，而来调控基因表达。（3）在翻译水平上，还可以通过小分子蛋白质的合成水平来影响基因表达。（4）温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。举如说明如下第95页/共163页温度影响的例子（1）大肠杆菌合成青霉素酰化酶，从37起随着温度的下降，青霉素酰化酶的合成产量逐渐增加，20-22时达到高峰，16以下，青霉素酰化酶的产量反而下降。这是由于在18-16时，工程菌生长减慢。实验证明，造成这种减慢的原因是由于温度影响了细胞内青霉素酰化酶mRN
38、A的浓度。（2）分泌型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子工程菌E.coliW3100/pGM-CSF，在 30时，蛋白质表达量最高，37时，由于细菌的热休克系统被激活，其蛋白质表达量反而下降。（3）重组人生长激素工程菌，在30时的产物是可溶的，而在37所表达出的蛋白质则是不溶的。第96页/共163页4、溶解氧的影响溶解氧对于工程菌发酵过程中的菌体代谢是具有十分重要的作用。细菌在大量扩增过程中，要进行消耗氧气的生化反应过程。因此，维持较高水平的溶解氧水平（DO240%），才能维持工程菌的快速生长和繁衍。分泌型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子工程菌E.coliW3100/pGM-CSF的发酵过程中，如果溶解
39、氧20%，则产生大量杂蛋白。影响以后的纯化。必须维持溶解氧25%的水平。采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。第97页/共163页5、诱导时机的影响对于PLclts875突变株工程菌来说，在28-30培养时，这时突变体能产生阻遏蛋白、来阻止启动子的转译。而当温度上升到42时，这种阻遏作用就消失。在这里，温度对于工程菌的表达起着诱导作用。一般来说，对于处在生长期后期的工程菌进行诱导，如菌体细胞密度在109个/ml时，通过升温诱导，可以达到蛋白质表达增产的效果。这在工业化生产中具有较大的潜力。第98页/共163页6、PH值的影响PH对于细胞的正常生长、外源蛋白的高效表达
40、都有影响。（1）细胞生长期的最佳PH范围是6.8-7.4。（2）外源蛋白表达的最佳PH范围是6.0-6.5。在发酵过程中，细菌自身对PH值具有一定的调节能力。当PH值超出其调节能力的范围时，就会影响细菌的生长。发酵前期，PH值可控制在7.0，随着蛋白质的表达，PH值不断下降，当PH6.0时，则应及时开动碱泵，加入碱液。第99页/共163页（五）基因工程菌的培养设备-生物反应器第100页/共163页基因工程药物的分离纯化技术（一）工程细菌所表达出蛋白质的特点（二）分离纯化技术的重要性（三）分离纯化的基本步骤和方法第101页/共163页（一）工程细菌所表达出蛋白质的特点1、目的产物在初始物料中含量
41、很低。2、初始产物的组成十分复杂。除了目的蛋白质之外，还含有残余细胞、代谢产物、残余培养基、各种无机盐。3、目的蛋白质的稳定性很差，容易失活、变性，对于温度、PH、金属离子、有机溶剂十分敏感和脆弱。4、目的蛋白质的种类繁多，存在着大小不同的片段。5、纯度不高、常常含有杂菌、热原等等物质。第102页/共163页（二）分离纯化技术的重要性为了获得高纯度、可供药用有生物活性蛋白质，必须对基因工程药物进行一定的分离和纯化。1、分离-以大肠杆菌为宿主的基因工程药物多为胞内产物，分离提取这类产物时，需要经过细胞收集、细胞破碎、细胞碎片分离的过程。2、纯化-经过破碎和分离之后，目的产物仍然存在着大量的杂质，
42、杂蛋白质、类似蛋白质的异构体，为了获得合格的目的产物，必须进行纯化操作。3、精制-非蛋白质类纯质在经过纯化操作之后，仍然无法除去，需要进行灭菌和精制操作。第103页/共163页 发酵液 细胞分离 胞内产物 胞外产物浓缩初步纯化高度纯化产品细胞破碎固液分离 包含体 细胞碎片浓缩初步纯化高度纯化制剂产品变性除膜复性浓缩初步纯化高度纯化制剂产品（三）分离纯化的基本步骤第104页/共163页分离纯化的基本方法1、细胞收集-离心法。2、细胞破碎：（1）机械破碎法-高压匀浆法、超声波破碎法、高速珠磨法、高压挤压法、（2）非机械破碎法-酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法。3、固液分离-离心法、膜过滤
43、法、双水相分配萃取法。4、纯化色谱技术-离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色彩谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱。5、除非蛋白质杂质技术-除DNA、除热原、除病毒。下面针对不同的技术作讲解-总共22种技术和方法。第105页/共163页基因工程药物的质量控制与传统意义上的药物生产不同，基因工程药物所获得的蛋白质，其相对分子量较大，并且多数是参与人体生理功能调节作用的蛋白质，极微量就可以产生显著反应，如白介素-12的作用剂量为0.1ug、干扰素的作用剂量也只须20-30ug。基因工程药物在药性、药剂上的任何偏差，都有会带来严重的人体损伤和危害，因此，必须对于进行十分严格的质量控制和检测。具体有以下
44、5项内容：（一）原材料的质量控制（二）培养过程的质量控制标准（三）纯化过程中的质量控制（四）目的产品的质量控制（五）产品的保存要求第106页/共163页（一）原材料的质量控制1、重组DNA序列的正确性。2、进行重组的基因工程菌必须来自单一克隆株。3、所使用的载体、质粒必须纯正、而且稳定。4、应明确以下各事项：（1）目的基因的来源（2）限制性内切酶的种类（3）载体的名称和遗传特性（4）基因重组的位点图谱（5）抗生素标记物（6）宿主细胞的名称和来源、传代历史（7）重组染色体的生物特性、拷贝数、遗传性（8）基因表达所导读的核苷酸序列（9）启动克隆基因在工程细菌中的表达水平第107页/共163页（二）
45、培养过程的质量控制标准1、工程菌菌种纯正、稳定。2、每一批次的菌种不含致癌基因，无杂菌、病毒、真菌和支原体的污染。3、发酵生产过程中，工程菌表达稳定。4、生产过程控制微生物污染。5、生产过程保证产量恒定。保证工程菌的稳定性，确定细胞的最高传种代数。6、定期检测工程菌的载体系统、质粒拷贝数、载体在工程细胞内是否丢失。第108页/共163页（三）纯化过程中的质量控制1、每一批次生产产物的一致性检验。2、外源蛋白质含量限度检验3、DNA限度检验4、热原限度检验：（1）血清学检验（2）鲎试剂（3）兔子热敏试验第109页/共163页（四）目的产品的质量控制基因工程产品的质量控制包括7项指标。1、产品鉴别
46、的定性分析2、纯度分析3、杂质检测4、生物活性测定5、稳定性考察6、产品一致性保证7、产品的安全性第110页/共163页1、产品鉴别的定性分析重组蛋白质药物常用的鉴定方法（8项检测）（1）电泳方法-聚丙烯酰安凝胶电泳（SDS-PAEG）、等电点电泳、免疫电泳。（2）免疫学分析方法-放射性免疫测定法（RIA）、放射性免疫扩散法（RID）、酶联免疫吸附法（ELISA），免疫印渍方法（immunoblotting）。（3）受体结合试验。（4）各种高效液相分析法（HPLC）。（5）肽图分析法。（6）氨基酸Edman N末端序列分析法（7）园二色谱方法（CD）（8）核磁共振（NMR）下面选择其中重要的方
47、法作讲解-5种第111页/共163页（1）肽图分析是通过酶解法、或者化学降解法的手段，对构成目的蛋白质的每一段肽链进行结构和成份分析的方法。肽图分析法是检测蛋白质一级结构中细微变化最为有效的方法。可以作为基因工程产品与天然产品之间进行精密比较的鉴别手段。方法上可采用：（1）各种高效液相分析法（HPLC），（2）毛细管电泳（CE）第112页/共163页（2）氨基酸成份分析这是一种对构成蛋白质的氨基酸单体进行测定的方法。缺点和局限性：（1）对于由不超过50个氨基酸组成的蛋白质，其测定精度较好，（2）当氨基酸数量超过100个时，就会出现较大的偏差。（3）相对分子量越大，其偏差就越严重。这是因为构成蛋
48、白质的肽链在水解过程中，有的水解并不完全，而有的则已经被破坏。第113页/共163页（3）部份氨基酸序列分析氨基酸Edman N末端序列分析法，可以作为蛋白质和肽链和重要测定指标。第114页/共163页（4）重组蛋白质浓度、相对分子量测定重组蛋白质的浓度测定方法有：（1）紫外分光光谱法，（2）双缩脲（BCA）法，（3）考马斯蓝法，（4）Loywry法，（5）凝胶染色与扫描分析法。重组蛋白质的相对分子量测定方法有：（1）凝胶过滤法，（2）聚丙烯酰胺聚胶电泳法。第115页/共163页（5）蛋白质二硫键分析二硫键的巯基与蛋白质的生物活性有着密切的关系。基因工程产物中的-S-S-键是否正确配对是一个重
49、要的问题。测定方法有：（1）对氯汞苯甲酸法（PCMB），（2）5、5-二巯基-双-2-硝基苯甲酸法（DTNB）第116页/共163页2、纯度分析目的蛋白质含量测定-通常根据目的蛋白质的理化性质、生物学特性来进行测定。采用的方法有4项检测：（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAEG）、（2）等电点电泳、（3）各种高效液相分析法（HPLC）、（4）毛细管电泳（CE）。第117页/共163页3、杂质检测杂质分为2 种类型：蛋白质杂质、非蛋白质杂质。（1）蛋白质杂质的主要来源（2）非蛋白质杂质主要类别（3）常见的杂质和污染物、以及检测方法第118页/共163页（1）蛋白质杂质的主要来源（A）残余的宿主
50、细胞蛋白质，（B）目的蛋白质自身变性、由于蛋白酶引起的降解、由于冷冻脱盐导致的沉淀、由于冻干引起的聚合。第119页/共163页（2）非蛋白质杂质主要类别（A）杂菌污染，可通过微生物学方法来测定。（B）热原质和内毒素，检测可用鲎试剂。（C）宿主细胞所残余的DNA，一般认为DNA残余含量小于100pg/剂量，是安全的。基测定方法可采用核酸杂交法。第120页/共163页（3）常见的杂质和污染物、以及检测方法杂质和污染物 常用检测方法-1：内毒素鲎试剂、家兔热原法2：宿主细胞蛋白质免疫分析、SDS-PAGE、CE3：其它蛋白质杂质（如培养基）免疫分析、SDS-PAGE、HPLC、CE4：残余DNA N