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1、第六节第六节蛋白质的分离纯化与鉴定蛋白质的分离纯化与鉴定The Separation and Purification of Protein一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质 蛋蛋白白质质分分子子除除两两端端的的氨氨基基和和羧羧基基可可解解离离外外，氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链中中某某些些基基团团，在在一一定定的的溶溶液液pHpH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于某某一一pH时时，蛋蛋白白质质解解离离成成正正、负负离离子子的的趋趋势势相相
2、等等，即即成成为为兼兼性性离离子子，净净电电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。二、二、蛋白质分子大小与形状蛋白质分子大小与形状用化学分析法测出蛋白质中某一微量元用化学分析法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设蛋白质分子中只含有素的含量，并假设蛋白质分子中只含有一个被测的元素原子，则可以由此计算一个被测的元素原子，则可以由此计算出蛋白质的出蛋白质的最低分子量最低分子量。真实分子量为最低分子量的真实分子量为最低分子量的n n倍倍有时蛋白质分子中某一氨基酸的含量特有时蛋白质分子中某一氨基酸的含量特别少，也可以按照这个原理测定最低分别少，也可以按照这个原
3、理测定最低分子量子量（一一一一）根根根根据据据据化化化化学学学学组组组组成成成成测测测测定定定定最最最最低低低低分分分分子子子子量量量量二、二、蛋白质分子大小与形状蛋白质分子大小与形状当用一种半透膜将蛋白质当用一种半透膜将蛋白质溶液与水隔开时，溶剂分溶液与水隔开时，溶剂分子将向蛋白质溶液中单向子将向蛋白质溶液中单向扩散，使溶液内的体积增扩散，使溶液内的体积增加，液面升高。直到达到加，液面升高。直到达到一定的静水压力时维持平一定的静水压力时维持平衡。此时的静水压力就是衡。此时的静水压力就是溶液在平衡浓度时的渗透溶液在平衡浓度时的渗透压。压。（二二）蛋蛋白白质质的的渗渗透透压压蛋白质的稀溶液：蛋白
4、质的稀溶液：蛋白质的稀溶液：蛋白质的稀溶液：渗透压（大气压）：渗透压（大气压）：渗透压（大气压）：渗透压（大气压）R R R R：气体常数：气体常数：气体常数：气体常数 T T T T：绝对温度：绝对温度：绝对温度：绝对温度 c c c c：溶质浓度（：溶质浓度（：溶质浓度（：溶质浓度（g/Lg/Lg/Lg/L）测定几个不同浓度的渗透压，用测定几个不同浓度的渗透压，用测定几个不同浓度的渗透压，用测定几个不同浓度的渗透压，用/c/c/c/c对对对对c c c c作图作图作图作图外推到蛋白质浓度为外推到蛋白质浓度为外推到蛋白质浓度为外推到蛋白质浓度为0 0 0 0，得到截距，代入公式，得到截距，代
5、入公式，得到截距，代入公式，得到截距，代入公式求得分子量。求得分子量。求得分子量。求得分子量。要求在等电点附近测定，并增高无机盐浓度要求在等电点附近测定，并增高无机盐浓度要求在等电点附近测定，并增高无机盐浓度要求在等电点附近测定，并增高无机盐浓度装置简单，准确，但不能判别样品是否纯净装置简单，准确，但不能判别样品是否纯净装置简单，准确，但不能判别样品是否纯净装置简单，准确，但不能判别样品是否纯净（二二）蛋蛋白白质质的的渗渗透透压压二、二、蛋白质分子大小与形状蛋白质分子大小与形状由于浓度差引起的溶质分子的净迁移称为由于浓度差引起的溶质分子的净迁移称为由于浓度差引起的溶质分子的净迁移称为由于浓度差
6、引起的溶质分子的净迁移称为扩散扩散扩散扩散。利用蛋白质的扩散，根据费克第二扩散定律利用蛋白质的扩散，根据费克第二扩散定律利用蛋白质的扩散，根据费克第二扩散定律利用蛋白质的扩散，根据费克第二扩散定律 测定在两个不同部位的浓度，可以计算出测定在两个不同部位的浓度，可以计算出测定在两个不同部位的浓度，可以计算出测定在两个不同部位的浓度，可以计算出D D D D值值值值扩散系数一般不单独用来决定分子量，要和其扩散系数一般不单独用来决定分子量，要和其扩散系数一般不单独用来决定分子量，要和其扩散系数一般不单独用来决定分子量，要和其他手段结合他手段结合他手段结合他手段结合（三三）蛋蛋白白质质的的扩扩散散二、
7、二、蛋白质分子大小与形状蛋白质分子大小与形状蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，会发生沉降。会发生沉降。会发生沉降。会发生沉降。沉降的速度与蛋白质的分子大小、形状和密度；沉降的速度与蛋白质的分子大小、形状和密度；沉降的速度与蛋白质的分子大小、形状和密度；沉降的速度与蛋白质的分子大小、形状和密度；溶液的密度和粘度有关。溶液的密度和粘度有关。溶液的密度和粘度有关。溶液的密度和粘度有关。研究沉降作用，采用每分钟研究沉降作用，采用每分钟研究沉降作用，采用每分钟研究沉降作用
8、，采用每分钟60000-8000060000-8000060000-8000060000-80000转的转的转的转的高速离心机，相当于重力的高速离心机，相当于重力的高速离心机，相当于重力的高速离心机，相当于重力的500000-600000500000-600000500000-600000500000-600000倍倍倍倍利用高速离心机测定蛋白质的分子量有两种方利用高速离心机测定蛋白质的分子量有两种方利用高速离心机测定蛋白质的分子量有两种方利用高速离心机测定蛋白质的分子量有两种方法，一种是沉降速度法，另一种是沉降平衡法法，一种是沉降速度法，另一种是沉降平衡法法，一种是沉降速度法，另一种是沉降平
9、衡法法，一种是沉降速度法，另一种是沉降平衡法此法还可以鉴定蛋白质分子的均一性此法还可以鉴定蛋白质分子的均一性此法还可以鉴定蛋白质分子的均一性此法还可以鉴定蛋白质分子的均一性（四四）蛋蛋白白质质的的沉沉降降分分析析1.1.1.1.沉降速度法沉降速度法沉降速度法沉降速度法把蛋白质样品溶液放在离心机内，蛋白质分子把蛋白质样品溶液放在离心机内，蛋白质分子把蛋白质样品溶液放在离心机内，蛋白质分子把蛋白质样品溶液放在离心机内，蛋白质分子将沿旋转中心向外周方向移动，并产生沉降界将沿旋转中心向外周方向移动，并产生沉降界将沿旋转中心向外周方向移动，并产生沉降界将沿旋转中心向外周方向移动，并产生沉降界面，界面的移
10、动速度代表蛋白质分子的沉降速面，界面的移动速度代表蛋白质分子的沉降速面，界面的移动速度代表蛋白质分子的沉降速面，界面的移动速度代表蛋白质分子的沉降速度。度。度。度。在界面处由于浓度差造成折射率不同，可借助在界面处由于浓度差造成折射率不同，可借助在界面处由于浓度差造成折射率不同，可借助在界面处由于浓度差造成折射率不同，可借助适当的光学系统，观察到界面的移动。适当的光学系统，观察到界面的移动。适当的光学系统，观察到界面的移动。适当的光学系统，观察到界面的移动。斯维得贝格方程斯维得贝格方程斯维得贝格方程斯维得贝格方程 M M=RT=RTs s/(1-)D/(1-)D s s s s：沉降系数；沉降系
11、数；沉降系数；沉降系数；s=dx/dt/s=dx/dt/s=dx/dt/s=dx/dt/2 2 2 2x x x x；把；把；把；把10101010-13-13-13-13秒秒秒秒作为一个单位，称为作为一个单位，称为作为一个单位，称为作为一个单位，称为斯维得贝格单位斯维得贝格单位斯维得贝格单位斯维得贝格单位，用，用，用，用S S S S表表表表示示示示 ：偏微比容；蛋白质溶于水：偏微比容；蛋白质溶于水：偏微比容；蛋白质溶于水：偏微比容；蛋白质溶于水0.74cm0.74cm0.74cm0.74cm3 3 3 3/g/g/g/g D D D D：扩散系数；：扩散系数；：扩散系数；：扩散系数；cmc
12、mcmcm2 2 2 2/s/s/s/s（四四）蛋蛋白白质质的的沉沉降降分分析析二、二、蛋白质分子大小与形状蛋白质分子大小与形状2.2.2.2.沉降平衡法沉降平衡法沉降平衡法沉降平衡法在在在在8000-20000r/min8000-20000r/min8000-20000r/min8000-20000r/min的离心力场中，分子颗粒的离心力场中，分子颗粒的离心力场中，分子颗粒的离心力场中，分子颗粒发生沉降，造成浓度梯度。扩散力和离心力平发生沉降，造成浓度梯度。扩散力和离心力平发生沉降，造成浓度梯度。扩散力和离心力平发生沉降，造成浓度梯度。扩散力和离心力平衡时，在离心管内从液面到液底形成一个由低
13、衡时，在离心管内从液面到液底形成一个由低衡时，在离心管内从液面到液底形成一个由低衡时，在离心管内从液面到液底形成一个由低到高的恒定浓度梯度。到高的恒定浓度梯度。到高的恒定浓度梯度。到高的恒定浓度梯度。MM=2RTln(c=2RTln(c2 2/c/c1 1)/(1-)/(1-)2 2(x(x2 22 2-x-x1 12 2)c c1 1和和c c2 2是离旋转中心是离旋转中心x x1 1和和x x2 2处的蛋白质浓度；只处的蛋白质浓度；只要实验测得要实验测得c1c1和和c2c2及及 和和，即可算出蛋白质的，即可算出蛋白质的分子量。分子量。（四四）蛋蛋白白质质的的沉沉降降分分析析二、二、蛋白质分
14、子大小与形状蛋白质分子大小与形状利用凝胶过滤层析法可以把蛋白质混合利用凝胶过滤层析法可以把蛋白质混合物按分子大小分离开。物按分子大小分离开。蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子的质量，而是它的斯笃克半取决于分子的质量，而是它的斯笃克半径。径。如果某种蛋白质与一理想的非水化球体如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度即相同的半径，称具有相同的过柱速度即相同的半径，称斯笃克半径。斯笃克半径。用凝胶过滤法测定分子量时，标准样品用凝胶过滤法测定分子量时，标准样品和待测蛋白质必须具有相同的形状。和待测蛋白质必须具有相同的形状。（五五）凝凝胶胶过过滤滤
15、法法测测定定分分子子量量凝胶过滤层析的工作原理凝胶过滤层析的工作原理分子筛层析，分子筛层析，分子筛层析，分子筛层析，Molecular-sieve Molecular-sieve chromatography;chromatography;凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤:Gel filtration Gel filtration chromato-graphy;chromato-graphy;或或或或 Gel retar-dation Gel retar-dation chromatography.chromatography.根据公式计算分子量：logM=K1-K2Ve K1、K2为常数
16、Ve：洗脱体积测定方法：测得几种标准蛋白质的Ve，并以它们的分子量对数对作图得一条直线，再测出待测样品的Ve，即可从图中查出它的分子量待测样品可以不纯测定蛋白质分子量一般用葡聚糖凝胶，可选用不同分离范围的凝胶。二、二、蛋白质分子大小与形状蛋白质分子大小与形状在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠和少量的巯基乙醇，则蛋白质分硫酸钠和少量的巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和分子形状无关。而与所带电荷和分子形状无关。SDSSDS是一种变性剂，能够使蛋白质的肽链是一种变性剂，能够使蛋白质的肽链伸
17、展。伸展。SDSSDS使多肽链带上相同的负电荷，使多肽链带上相同的负电荷，掩盖掩盖了不同种类蛋白质间的电荷差别，结果了不同种类蛋白质间的电荷差别，结果所有的所有的SDS-SDS-蛋白质复合物电泳时都以同蛋白质复合物电泳时都以同样的电荷样的电荷/蛋白质比向正极移动。蛋白质比向正极移动。（六六）S SD DS S聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳二、二、蛋白质分子大小与形状蛋白质分子大小与形状SDSSDS与蛋白质结合，改变了蛋白质单体分与蛋白质结合，改变了蛋白质单体分子的构象，子的构象，SDS-SDS-蛋白质复合物在水溶液蛋白质复合物在水溶液中的形状是椭圆棒状，不同蛋白质的中的形状是椭圆棒状，不
18、同蛋白质的SDSSDS复合物的短轴长度约为复合物的短轴长度约为1.8nm1.8nm，长轴长度，长轴长度随蛋白质的分子量成正比随蛋白质的分子量成正比蛋白质蛋白质SDS-PAGESDS-PAGE的迁移率与原有电荷、的迁移率与原有电荷、分子形状等无关分子形状等无关logM=KlogM=K1 1-K-K2 2R R R:R:相对迁移率。为：样品迁移距离相对迁移率。为：样品迁移距离/前沿前沿迁移距离迁移距离（六六）S SD DS S聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳二、二、蛋白质分子大小与形状蛋白质分子大小与形状测定几种标准单体蛋白分子量的对数值，测定几种标准单体蛋白分子量的对数值，对其对其R R值作
19、图，再根据待测样品的值作图，再根据待测样品的R R，从标准曲线上查出它的分子量。从标准曲线上查出它的分子量。（六六）S SD DS S聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳二、二、蛋白质分子大小与形状蛋白质分子大小与形状蛋白质分子的形状或构象的测定方法是蛋白质分子的形状或构象的测定方法是X X射线晶体结构分析。射线晶体结构分析。测定蛋白质分子在溶液中的摩擦系数可测定蛋白质分子在溶液中的摩擦系数可以判断蛋白质分子的形状以判断蛋白质分子的形状 蛋白质的摩擦系数蛋白质的摩擦系数 f=RT/ND f=RT/ND 理想刚性球体的摩擦系数理想刚性球体的摩擦系数 f/f0 0是蛋白质分子的摩擦比是蛋白质分子的
20、摩擦比 （七七）蛋蛋白白质质分分子子的的形形状状二、二、蛋白质分子大小与形状蛋白质分子大小与形状当摩擦比大于当摩擦比大于1.01.0时，蛋白质分子的形状时，蛋白质分子的形状是不对称或者是水化的。是不对称或者是水化的。摩擦比越大，反映蛋白质分子的不对称摩擦比越大，反映蛋白质分子的不对称性越高性越高摩擦比又叫蛋白质的不对称常数，作为摩擦比又叫蛋白质的不对称常数，作为蛋白质分子形状偏离真正球体程度的衡蛋白质分子形状偏离真正球体程度的衡量量（七七）蛋蛋白白质质分分子子的的形形状状三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质溶液是一种分散体系。蛋白质溶液是一种分散体系。蛋白
21、质分子蛋白质分子分散相分散相 水水 分散介质分散介质蛋白质的分子大小介于蛋白质的分子大小介于1-100nm1-100nm，为胶体溶，为胶体溶液液胶体溶液保持稳定的条件：胶体溶液保持稳定的条件：第一：分散相质点大小在第一：分散相质点大小在1-100nm1-100nm 第二：分散相的质点带有同种电荷，不易聚第二：分散相的质点带有同种电荷，不易聚集集 第三：分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层第三：分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层蛋蛋白白质质的的胶胶体体性性质质蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素l l颗粒表面电荷颗粒表面电荷l l水化膜水化膜蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，蛋白质溶液具有胶体溶液
22、的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。分子杂质除去。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的胶胶胶胶体体体体性性性性质质质质蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。沉淀出来。蛋蛋蛋蛋白白
23、白白质质质质的的的的沉沉沉沉淀淀淀淀在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpH或电或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。剂沉淀法等。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的沉沉沉沉
24、淀淀淀淀作作作作用用用用可逆沉淀可逆沉淀等电点沉淀法：改变溶液的等电点沉淀法：改变溶液的pHpH值达到蛋值达到蛋白质的等电点使蛋白质分子失去净电荷白质的等电点使蛋白质分子失去净电荷盐析法：向蛋白质中加入大量的中性盐盐析法：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠）使蛋白脱去水化层（硫酸铵、硫酸钠）使蛋白脱去水化层而沉淀而沉淀有机溶剂沉淀法：加入一定量的极性有有机溶剂沉淀法：加入一定量的极性有机溶剂，引起蛋白质脱去水化层而沉淀机溶剂，引起蛋白质脱去水化层而沉淀蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的沉沉沉沉淀淀淀淀作作作作用用用用可逆沉淀可逆沉淀在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质在强烈沉淀条件下，不仅
25、破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的沉沉沉沉淀淀淀淀作作作作用用用用不可逆沉淀不可逆沉淀加热沉淀：加热变性而凝固，等电点时，加热沉淀：加热变性而凝固，等
26、电点时，加热凝固最完全。加热变性使蛋白质天加热凝固最完全。加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露。然结构解体，疏水基外露。重金属盐沉淀：蛋白质在溶液的重金属盐沉淀：蛋白质在溶液的pHpH大于大于等电点时，带负电荷，容易和重金属离等电点时，带负电荷，容易和重金属离子形成不溶性沉淀。子形成不溶性沉淀。生物碱和强酸碱沉淀：鞣酸、苦味酸、生物碱和强酸碱沉淀：鞣酸、苦味酸、碘化钾、硝酸等易和蛋白质生成沉淀。碘化钾、硝酸等易和蛋白质生成沉淀。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的沉沉沉沉淀淀淀淀作作作作用用用用不可逆沉淀不可逆沉淀四、蛋白质分离提纯的一般原则四、蛋白质分离提纯的一般原则蛋白质提纯的蛋白质提纯的
27、目标目标是增加纯度或比活性是增加纯度或比活性比活性比活性：单位蛋白质重量中所需的蛋白质的：单位蛋白质重量中所需的蛋白质的含量或生物活性。含量或生物活性。分离提纯蛋白质的分离提纯蛋白质的一般程序一般程序：step1:step1:前处理（前处理（pretreatment)pretreatment)step2:step2:粗分级粗分级(rough fractionation)(rough fractionation)step3:step3:细分级细分级(fine fractionation)(fine fractionation)前处理要求把蛋白质从原来的组织或细前处理要求把蛋白质从原来的组织或细胞
28、中以溶解的状态释放出来，并保持原胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态和生物活性。来的天然状态和生物活性。动物组织和细胞用电动捣碎机或匀浆机动物组织和细胞用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理法破碎。破碎或用超声波处理法破碎。植物组织和细胞用石英砂和适当的提取植物组织和细胞用石英砂和适当的提取液一起研磨破碎或用纤维素酶处理液一起研磨破碎或用纤维素酶处理细菌细胞的破碎用超声波振荡，与砂研细菌细胞的破碎用超声波振荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理，分解肽聚磨、高压挤压或溶菌酶处理，分解肽聚糖。糖。组织或细胞破碎以后选择适当的缓冲液组织或细胞破碎以后选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。把
29、所要的蛋白质提取出来。前前处处理理如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分中，可以采用差速离心方法将它分组分中，可以采用差速离心方法将它分开。开。如果蛋白质和细胞膜或膜质细胞器结合如果蛋白质和细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。构解聚，然后用适当介质提取。前前处处理理粗分级：粗分级：一般采用盐析、等电点沉淀和有机溶剂一般采用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离分级分离这些方法的特点是简便、处理量大，可这些方法的特点是简便、处理量大，可以除去杂质又能浓缩蛋白质溶液。以除去杂质又能浓缩蛋
30、白质溶液。细分级：细分级：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等亲和层析等电泳法，包括区带电泳、等电聚焦作为电泳法，包括区带电泳、等电聚焦作为最后的提纯步骤最后的提纯步骤必要时结晶提纯必要时结晶提纯粗粗分分级级和和细细分分级级五、蛋白质混合物的分离方法五、蛋白质混合物的分离方法根据蛋白质在溶液中的下列性质分离蛋白质根据蛋白质在溶液中的下列性质分离蛋白质混合物：混合物：（1）分子的大小）分子的大小（2）溶解度）溶解度（3）电荷）电荷（4）吸附性质）吸附性质（5）对其它分子的生物学亲和力）对其它分子的生物学亲和力（一）根据分子大小不同的分离方法1.1.1.1
31、.透析和超过滤透析和超过滤透析和超过滤透析和超过滤利用蛋白质分子不能通过半透膜的性利用蛋白质分子不能通过半透膜的性利用蛋白质分子不能通过半透膜的性利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质分离。质，使蛋白质和其它小分子物质分离。质，使蛋白质和其它小分子物质分离。质，使蛋白质和其它小分子物质分离。半透膜：玻璃纸、赛璐玢纸、火棉纸半透膜：玻璃纸、赛璐玢纸、火棉纸半透膜：玻璃纸、赛璐玢纸、火棉纸半透膜：玻璃纸、赛璐玢纸、火棉纸或其它材料或其它材料或其它材料或其它材料透析时将待提纯的蛋白质溶液装在半透析时将待提纯的蛋白质溶液装在半透析时将待提纯的蛋白质溶液装在半透析时将待提纯的蛋白质
32、溶液装在半透膜的透析袋里放在蒸馏水或缓冲液透膜的透析袋里放在蒸馏水或缓冲液透膜的透析袋里放在蒸馏水或缓冲液透膜的透析袋里放在蒸馏水或缓冲液中，透析液可更换，直到透析袋内无中，透析液可更换，直到透析袋内无中，透析液可更换，直到透析袋内无中，透析液可更换，直到透析袋内无机盐浓度降到最低为止机盐浓度降到最低为止机盐浓度降到最低为止机盐浓度降到最低为止超过滤是利用压力或离心力强行使水和其它小分超过滤是利用压力或离心力强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质截流在膜上子溶质通过半透膜，而蛋白质截流在膜上2.2.密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，每蛋白质颗
33、粒在具有密度梯度的介质中离心时，每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分时即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带离成各自独立的区带常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度和常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度和其他合成材料的密度梯度。其他合成材料的密度梯度。6060蔗糖溶液密度可达蔗糖溶液密度可达1 12828克厘米克厘米聚蔗糖的商品名是聚蔗糖的商品名是Ficoll,Ficoll,是由蔗糖和是由蔗糖和1-1-氯氯-2 2，3-3-环氧丙烷合成的高聚物，分子量约环氧丙烷合成的高聚物，分子量约4
34、00000400000。密度梯度在离心管内的分布是管底的密度最密度梯度在离心管内的分布是管底的密度最大，向上逐渐减小大，向上逐渐减小使用密度梯度可以消除因对流和机械振动引使用密度梯度可以消除因对流和机械振动引起的区带界面的扰乱。起的区带界面的扰乱。3.凝胶过滤凝胶过滤的介质 凝胶过滤所用的介质是凝胶珠，多孔网状结构。凝胶的交联度或孔度决定了凝胶分离开来的蛋白质混合物的分子量范围。经常使用的凝胶有交联葡聚糖，聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖等。3.凝胶过滤凝胶过滤的原理 VtVt为凝胶柱床的总体积，为凝胶柱床的总体积，常称柱床体积。常称柱床体积。VeVe为某一溶质组分的洗为某一溶质组分的洗脱体积。脱体积。
35、VoVo为孔隙体积或称外体为孔隙体积或称外体积、外水体积积、外水体积ViVi为内体积或称内水体积为内体积或称内水体积VmVm为凝胶基质体积为凝胶基质体积凝胶床内：凝胶床内：Vt=Vo+Vi+Vm Vt=Vo+Vi+Vm凝胶珠的总体积：凝胶珠的总体积：Vt-Vo=Vi+VmVt-Vo=Vi+Vm凝胶过滤可以看成是一种液凝胶过滤可以看成是一种液-液分配层析。凝胶珠液分配层析。凝胶珠内的水相是固定相内的水相是固定相(Vi)(Vi)，凝胶珠外的水相是流动，凝胶珠外的水相是流动相相(Vo)(Vo)。溶质在柱中的移动速度取决于它在两相之间的分溶质在柱中的移动速度取决于它在两相之间的分配系数配系数(Kd)(
36、Kd)：Kd=Kd=（Ve-VoVe-Vo）/Vi/Vi对于完全被排阻在凝胶珠之外的大分子来说，它对于完全被排阻在凝胶珠之外的大分子来说，它们将在同一洗脱峰出现，们将在同一洗脱峰出现，VeVeVoVo，KdKd0 0；对于完全能自由出入凝胶珠内外的小分子，对于完全能自由出入凝胶珠内外的小分子，Ve=Vo+ViVe=Vo+Vi，KdKd1 1；对于在分级范围内的中等分子，对于在分级范围内的中等分子，KdKd总是在总是在0 0与与1 1之之间。间。如果如果KdKd1 1，这表明凝胶对溶质有吸附作用。，这表明凝胶对溶质有吸附作用。由于测定Vi有困难，所以用凝胶柱内的总体积代替内体积，Kd改成Kav，
37、Kav称为可用分配系数 Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）只要测得Vt、Vo和Ve，即可测出Kav值。对于两种不同分子量和不同Kav值的组分，它们的洗脱体积之差 Vs=Ve-Ve”=(Kav-Kav”)(Vt-Vo)为了完全分开两种组分，样品的体积一定不能大于Vs。（二）利用溶解度差别的分离方法（二）利用溶解度差别的分离方法影响蛋白质溶解度的外界因素：影响蛋白质溶解度的外界因素：(1)(1)溶液的溶液的pHpH，(2)(2)离子强度，离子强度，(3)(3)介电常数介电常数 (4)(4)温度。温度。因为溶解度归根结底取决于它们本身的分子结构因为溶解度归根结底取决于它们本身的分子结构根据蛋白质
38、分子结构的特点，适当地改变外界因根据蛋白质分子结构的特点，适当地改变外界因素就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分素就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度，作为分离和纯化蛋白质的一种手段。的溶解度，作为分离和纯化蛋白质的一种手段。1等电点沉淀和pH控制 当蛋白质处于等电点pH时蛋白质的净电荷为零，蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于结聚而沉淀，因此它的溶解度达到最低点。当蛋白质混合物的pH被调到其中一种成分的等电点pH时这种蛋白质的大部分或全部将沉淀下来。沉淀出来的等电蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。2蛋白质的盐溶和盐析 盐溶：低浓度时，中性盐可以增加
39、蛋白质的溶解度，这低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为种现象称为盐溶盐溶。蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度提高。相互作用却加强，因而溶解度提高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出。中性盐影响蛋白质溶解度的能力是它们的离子强中性盐影响蛋白质溶解度的能力是它们的离子强度的函数。度的函数。离子强度离子强度定义为：定义为：mmi i为各种离子的浓度；为各种离子的浓度；z zi i为各种离子的
40、净电荷为各种离子的净电荷计算离子强度时，仅用离子的净电荷，未解离的计算离子强度时，仅用离子的净电荷，未解离的电解质或携带正负电荷数相等的兼性离子电解质或携带正负电荷数相等的兼性离子(如中性如中性氨基酸氨基酸)并不增强溶液的离子强度并不增强溶液的离子强度。盐析：当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析；盐析作用主要降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。盐析沉淀的蛋白质保持着它的天然构象，能再溶解。用于盐析的中性盐以硫酸铵为最佳因为它在水中的溶解度很高，而溶解时的温度系数则较
41、低。在0下，硫酸铵浓度由饱和度S1增至S2，应向1升溶液中添加的固体硫酸铵的克数为：S1和S2为起始饱和度和终了饱和度 505是0 时1000mL饱和硫酸铵(100%或1.00饱和度)溶液中所含的(NH4)2SO4的克数(即505克l000毫升溶液）100100毫升硫酸铵溶液，由饱和度毫升硫酸铵溶液，由饱和度S S1 1变为变为S S2 2，应向，应向其中加入饱和硫酸铵的体积毫升数其中加入饱和硫酸铵的体积毫升数V V：3.3.有机溶剂分级法有机溶剂分级法与水互溶的有机溶剂能使蛋白质在水中的溶解与水互溶的有机溶剂能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，引起蛋白质沉淀。度显著降低，引起蛋白质沉淀。将有机
42、溶剂冷却到将有机溶剂冷却到-40-40至至-60 -60 ，然后在不，然后在不断地搅拌下逐滴加入，可防止蛋白质变性。断地搅拌下逐滴加入，可防止蛋白质变性。在一定温度、在一定温度、pHpH和离子强度条件下，控制有机和离子强度条件下，控制有机溶剂的浓度，可以分离蛋白质。溶剂的浓度，可以分离蛋白质。有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变介质的介电常数。是改变介质的介电常数。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式是与蛋白质争夺水化水致使蛋白质聚集体是与蛋白质争夺水化水致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。的形成并沉淀。水溶性非离子聚合物
43、聚乙二醇也能引起蛋水溶性非离子聚合物聚乙二醇也能引起蛋白质沉淀。白质沉淀。聚乙二醇的主要作用可能是脱去蛋白质的聚乙二醇的主要作用可能是脱去蛋白质的水化层；水化层；蛋白质在聚乙二醇中的溶解度明显地依赖蛋白质在聚乙二醇中的溶解度明显地依赖于聚乙二醇的分子量于聚乙二醇的分子量温度对蛋白质溶解度的影响温度对蛋白质溶解度的影响在在0-40之间，大部分球状蛋白质的溶解度之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加。随温度升高而增加。例外：人的血红蛋白从例外：人的血红蛋白从0到到25 之间，溶解之间，溶解度随温度上升而降低。度随温度上升而降低。在在40-50 以上大部分蛋白质变得不稳定并以上大部分蛋白质变
44、得不稳定并开始变性。开始变性。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在白质的分级分离操作一般都在0 或更低的或更低的温度下进行。温度下进行。血浆蛋白质的分级分离血浆蛋白质的分级分离(三三)根据电荷不同的分离方法根据电荷不同的分离方法电泳和离子交换层析电泳和离子交换层析1 1电泳电泳 在外电场的作用下，不处于等电状态的蛋白质分在外电场的作用下，不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳称电泳电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸和电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋白质、核
45、苷酸和核酸等生物分子的分离分析和制备。核酸等生物分子的分离分析和制备。带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。的净电荷量以及颗粒的大小和形状。颗粒在电场中发生泳动时，将受到两种方向相反的力的作用：q颗粒所带的电量E电场强度或电势梯度U/SU两电极间的电势差(以伏特表示)S两电极之间距离(以厘米表示)f摩擦系数(与颗粒的形状大小和介质的粘度有关)v颗粒泳动速度(以厘米秒表示)当颗粒以恒速移动时，则F-Ff=0，因此qE=fv，即在一定的介质中对某一种蛋白质来说q/f是一个定值，因而v/E也是定值，它被称为迁移率或泳动度：
46、值可以通过实验测得，蛋白质的0.110-4-1.010-4厘米2伏特-1 秒-1。或称界面移动电泳或称界面移动电泳自自由由电电泳泳由于在支持物上电泳时各组分因迁移速度不同由于在支持物上电泳时各组分因迁移速度不同由于在支持物上电泳时各组分因迁移速度不同由于在支持物上电泳时各组分因迁移速度不同分布成区带而得名。分布成区带而得名。分布成区带而得名。分布成区带而得名。区带电泳按其支持介质的物理性状不同可以分区带电泳按其支持介质的物理性状不同可以分区带电泳按其支持介质的物理性状不同可以分区带电泳按其支持介质的物理性状不同可以分成四类：成四类：成四类：成四类：(1)(1)滤纸电泳和薄膜电泳滤纸电泳和薄膜电
47、泳滤纸电泳和薄膜电泳滤纸电泳和薄膜电泳(醋酸纤维薄膜电泳和聚醋酸纤维薄膜电泳和聚醋酸纤维薄膜电泳和聚醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳等酰胺薄膜电泳等酰胺薄膜电泳等酰胺薄膜电泳等)；(2)(2)粉末电泳：支持介质是淀粉、纤维素粉或硅粉末电泳：支持介质是淀粉、纤维素粉或硅粉末电泳：支持介质是淀粉、纤维素粉或硅粉末电泳：支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板(3)(3)细丝电泳，如尼龙丝和其他人造丝电泳细丝电泳，如尼龙丝和其他人造丝电泳细丝电泳，如尼龙
48、丝和其他人造丝电泳细丝电泳，如尼龙丝和其他人造丝电泳(4)(4)凝胶电泳，最常用的支持介质有聚丙烯酰胺凝胶电泳，最常用的支持介质有聚丙烯酰胺凝胶电泳，最常用的支持介质有聚丙烯酰胺凝胶电泳，最常用的支持介质有聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。和琼脂糖凝胶。和琼脂糖凝胶。和琼脂糖凝胶。区区带带电电泳泳氨基酸混合物特别是寡核苷酸混合物一氨基酸混合物特别是寡核苷酸混合物一次电泳往往不能完全分开。这种情况可次电泳往往不能完全分开。这种情况可以将第一次电泳分开的斑点通过支持介以将第一次电泳分开的斑点通过支持介质间的接触吸印转移到第二个支持介质质间的接触吸印转移到第二个支持介质上，旋转上，旋转90。进行第二次电泳。这
49、种方法进行第二次电泳。这种方法被称为被称为双向电泳双向电泳区区带带电电泳泳以聚丙烯酰胺凝胶为支持物以聚丙烯酰胺凝胶为支持物凝胶柱由相连的两节不连续的凝胶组成，凝胶柱由相连的两节不连续的凝胶组成，这样电泳时样品首先在不连续的两相间这样电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带，然后再积聚浓缩而成很薄的起始区带，然后再进行电泳分离。进行电泳分离。在盘状电泳过程中有三种物理效应：在盘状电泳过程中有三种物理效应：(1)样品的浓缩效应；样品的浓缩效应；(2)凝胶对分子的筛选效应凝胶对分子的筛选效应 (3)一般电泳分离的电荷效应一般电泳分离的电荷效应聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳等电聚
50、焦时，蛋白质混合物的分离是在等电聚焦时，蛋白质混合物的分离是在具有具有pH梯度的蔗糖介质中进行的。梯度的蔗糖介质中进行的。在电场内，每种蛋白质成分将移向并停在电场内，每种蛋白质成分将移向并停留在等于其等电点的留在等于其等电点的pH梯度处，形成一梯度处，形成一个很窄的区带。个很窄的区带。等电聚焦分辨率很高等电聚焦分辨率很高凝胶等电聚焦是用聚丙烯酰胺凝胶代替凝胶等电聚焦是用聚丙烯酰胺凝胶代替原来的蔗糖溶液，由于介质固体化，操原来的蔗糖溶液，由于介质固体化，操作方便，分离时间缩短作方便，分离时间缩短(只需只需l-3小时小时)。此法适用于蛋白质的微量分析此法适用于蛋白质的微量分析(10-50微微克克)