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1、第7章 蛋白质的分离、纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质分子的大小与形状二、蛋白质分子的大小与形状三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀四、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质分离纯化的一般原则五、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质的分离纯化方法六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定(Isolation,purification and characteristics of proteins)表征：事物显露在外的征象表征：事物显露在外的征象一、蛋白质的酸碱性质蛋白质的等电点和等离子点 对某一种蛋白质来说，在某一对某一种蛋白
2、质来说，在某一pH下，它所带的下，它所带的正电荷总数与负电荷总数刚好相等，这个正电荷总数与负电荷总数刚好相等，这个pH叫该蛋叫该蛋白质的等电点（白质的等电点（Isoelectric point）。）。在没有其它盐在没有其它盐类干扰时，蛋白质的质子供体基团解离出的质子数类干扰时，蛋白质的质子供体基团解离出的质子数与质子受体基团接受的质子数相等时的与质子受体基团接受的质子数相等时的pH叫该蛋白叫该蛋白质的等离子点（质的等离子点（isoionic point）。等离子点是蛋白）。等离子点是蛋白质的一个特征常数？质的一个特征常数？ 二、蛋白质分子的大小与形状根据化学组成测定最低分子量 用化学分析的方法
3、测出蛋白质中某一物质（原用化学分析的方法测出蛋白质中某一物质（原子）或某一含量很低的氨基酸残基的含量，并假设子）或某一含量很低的氨基酸残基的含量，并假设蛋白质分子中只有一个该物质分子或原子，则可以蛋白质分子中只有一个该物质分子或原子，则可以计算出该蛋白质的最低分子量。例如，肌红蛋白含计算出该蛋白质的最低分子量。例如，肌红蛋白含铁量为铁量为0.335%，其最低分子量可按下式算出：，其最低分子量可按下式算出：16700100335. 08 .55100335. 0铁的原子量蛋白质的分子量%335. 0%100铁的原子量蛋白质的分子量根据化学组成测定最低分子量 若蛋白质中含有若蛋白质中含有n个被测原
4、子，则分子量等于个被测原子，则分子量等于最低分子量最低分子量n . . 若蛋白质中某种氨基酸的含量特别低，通过若蛋白质中某种氨基酸的含量特别低，通过测定这种氨基酸的含量，也可用此法计算出蛋白测定这种氨基酸的含量，也可用此法计算出蛋白质的分子量。质的分子量。渗透压法测定蛋白质的分子量 在一种理想溶液中，渗透压与溶质浓度成正比。在一种理想溶液中，渗透压与溶质浓度成正比。但是实际上蛋白质溶液与理想溶液有较大的偏差。但是实际上蛋白质溶液与理想溶液有较大的偏差。在溶质浓度不大时，它们的关系可用下式表示：在溶质浓度不大时，它们的关系可用下式表示： 2KcMcRTrRTKcMRTcrcRTMcr0limRT
5、KccRTMr 当当c 趋向于趋向于0时，时，RTKc 趋向于趋向于0，但，但/c 不趋向于不趋向于0，而，而是趋向于一定值。是趋向于一定值。渗透压法测定蛋白质的分子量 测定几个不同浓度下的渗透压，以测定几个不同浓度下的渗透压，以/c对对c作图，作图，并外推至并外推至c为为0时的时的/c，再代入上式求得，再代入上式求得Mr。 为了避免蛋白质带电荷引起其它无机离子分为了避免蛋白质带电荷引起其它无机离子分布不均匀对渗透压的影响，在溶解度许可的范围布不均匀对渗透压的影响，在溶解度许可的范围内，尽量采用等电点或接近于等电点的缓冲液作内，尽量采用等电点或接近于等电点的缓冲液作膜内外的溶剂，并增加缓冲液中
6、无机盐的浓度。膜内外的溶剂，并增加缓冲液中无机盐的浓度。沉降分析法测定蛋白质的分子量 用沉降分析法测定蛋白质分子的相对分子量用沉降分析法测定蛋白质分子的相对分子量需要超速离心机，超速离心机的转速可以达到每需要超速离心机，超速离心机的转速可以达到每分钟分钟6万万8万转，这样高的转速使得被离心的分万转，这样高的转速使得被离心的分子受到的离心力达到子受到的离心力达到40万万70万万g。 超速离心机工作原理制备型超速离心机制备型超速离心机分析型超速离心机分析型超速离心机被离心分子的受力分析沉降速度法 在离心场中蛋白质分子颗粒发生沉降时，它将受在离心场中蛋白质分子颗粒发生沉降时，它将受到三种力的作用：到
7、三种力的作用： xmFpc2)(离心力xvmxVFppb22)(浮力dtdxfvfFf)(摩擦力离心力减去浮力为分子颗粒受到的净离心力：离心力减去浮力为分子颗粒受到的净离心力： )1 (222vxmxvmxmFFpppbc 式中式中m p是分子颗粒的质量（是分子颗粒的质量（g）；）；是转头的角是转头的角速度（速度（rad/s）；）；x是旋转轴心至界面的径向距离是旋转轴心至界面的径向距离（cm）；）；2 x是离心加速度；是离心加速度；V p是分子颗粒的体积；是分子颗粒的体积；是溶剂的密度（是溶剂的密度（g/cm3）；）； 是蛋白质的偏微分比容是蛋白质的偏微分比容（偏微分比容：当加入（偏微分比容：
8、当加入1g干物质到无限大体积的溶干物质到无限大体积的溶剂中时，溶液体积的增量）；剂中时，溶液体积的增量）；V p或是被分子颗粒或是被分子颗粒排开的溶剂的质量；排开的溶剂的质量；f是摩擦系数；是摩擦系数；v是沉降速度，是沉降速度，即即dx/dt。 v沉降速度法fFFFbcdtdxfvxmp)1 (2fvmxdtdxp)1 (2 当分子颗粒以恒定速度移动时，净离心力与摩当分子颗粒以恒定速度移动时，净离心力与摩擦力大小相等，方向相反：擦力大小相等，方向相反：即即整理得整理得 等号左边为单位离心场的沉降速度，右边为定值，等号左边为单位离心场的沉降速度，右边为定值，可见单位离心场的沉降速度是一个定值。将
9、此定值称可见单位离心场的沉降速度是一个定值。将此定值称为沉降系数（为沉降系数（sedimentation coefficient），用），用 s（小（小写）表示。写）表示。 沉降速度法dtxddtxddtxdxxdtdxs2222log303. 2ln 是是log x对对t t作图所得直线的斜率，因此测得在作图所得直线的斜率，因此测得在t t1, t2, t3, 时间相应的时间相应的x x1, x2, x3, ，作图求出斜率，作图求出斜率，代入上式即可求出沉降系数代入上式即可求出沉降系数 s，沉降系数的单位是，沉降系数的单位是秒。秒。 dtxd log沉降速度法 蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的
10、沉降系数蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数介于介于11013到到2001013秒之间。为了使用方秒之间。为了使用方便，以便，以1013秒为一个沉降系数的单位，称为斯维秒为一个沉降系数的单位，称为斯维得贝格单位（得贝格单位（Svedberg unit），或称沉降系数单），或称沉降系数单位，用位，用 S（大写）表示。如人血红蛋白的（大写）表示。如人血红蛋白的s为为4.461013秒，即秒，即4.46S。 沉降速度法)()(,202020btpwwpbtbtwss 由于测定时温度和溶剂性质对由于测定时温度和溶剂性质对 s 值都有影响，需值都有影响，需要校正成标准条件下的要校正成标准条件下的 s
11、值，这样才便于比较。标准值，这样才便于比较。标准条件是条件是20，溶剂是水。标准条件下的，溶剂是水。标准条件下的 s 值记为值记为s 20, w 。校正公式如下：校正公式如下： 由于蛋白质浓度增加，分子间可能彼此干扰，使由于蛋白质浓度增加，分子间可能彼此干扰，使得得 s 值减小。为排除因蛋白质浓度造成的测定误差，值减小。为排除因蛋白质浓度造成的测定误差，可测出一系列在不同浓度蛋白质溶液中的可测出一系列在不同浓度蛋白质溶液中的 s 值，然后值，然后外推至浓度为外推至浓度为0时的时的s 20, w 。 蛋白质分子颗粒的质量蛋白质分子颗粒的质量 ，爱因斯坦萨，爱因斯坦萨德兰德方程：德兰德方程： 。式
12、中。式中M r 是蛋白质的分子量，是蛋白质的分子量，N为阿伏加德罗常数，为阿伏加德罗常数，f为摩擦系数，为摩擦系数，R为气体常数，为气体常数，T为绝对温度，为绝对温度，D为扩散系数。为扩散系数。将上述两式代入将上述两式代入 得得沉降速度法NMmrpNDRTf fvmsp)1 ()1 (vRTNDNMsr)1 (vDsRTMr 此式称为此式称为Svedberg方程，代入各种数据可计算方程，代入各种数据可计算出蛋白质的分子量。蛋白质的出蛋白质的分子量。蛋白质的 约为约为0.74 cm3/gv氨基酸残基的偏微分比容氨基酸氨基酸偏微分比容偏微分比容(cm3/g)氨基酸氨基酸偏微分比容偏微分比容(cm3
13、/g)Gly0.64Cys0.61Ala0.74Trp0.74Ser0.63Tyr0.71Thr0.70His0.67Val0.86Arg0.70Leu、Ile0.90Lys0.82Pro0.76Asp0.60Met0.75Glu0.66Phe0.77Gln0.67沉降平衡法测蛋白质的分子量沉降平衡法 利用沉降平衡法测蛋白质的分子量是在较低离利用沉降平衡法测蛋白质的分子量是在较低离心转速下进行的（心转速下进行的（800020000r/min），离心开始），离心开始时，分子颗粒发生沉降，一段时间以后，沉降的结时，分子颗粒发生沉降，一段时间以后，沉降的结果造成了浓度梯度，因而产生了蛋白质分子反向扩
14、果造成了浓度梯度，因而产生了蛋白质分子反向扩散运动，当反向扩散与离心沉降达到平衡时，浓度散运动，当反向扩散与离心沉降达到平衡时，浓度梯度就固定不变了。梯度就固定不变了。 沉降平衡法 在离心力作用下，蛋白质颗粒的沉降速度为在离心力作用下，蛋白质颗粒的沉降速度为dx/dt，在此沉降速度下，时间，在此沉降速度下，时间t内浓度为内浓度为c的溶液越的溶液越过横截面过横截面A的溶质量为的溶质量为 dtdtdxcAdm 因扩散作用沿相反方向越过横因扩散作用沿相反方向越过横截面截面A的溶质量为的溶质量为 dtdxdcDAmd沉降平衡法当达到平衡时当达到平衡时 ， 0 mddmdtdxdcDAdtdtdxcAd
15、xdcDdtdxc将将 和和 代入上式得代入上式得 xvfmdtdxp2)1 (NfRTD dxdcNfRTxvfmcp2)1 (xdxcdcRTvNmp2)1 (2221ln)1 (dxcdRTvMr，22ln)1 (2dxcdvRTMr沉降平衡法积分并代入积分限得积分并代入积分限得 )()/ln()1 (22122122xxccvRTMr 式中，式中，c1, c2是距离旋转轴心是距离旋转轴心x1, x2处的蛋白质处的蛋白质浓度，通过离心机上的光学系统可以测出这两个数浓度，通过离心机上的光学系统可以测出这两个数据。将各种数据代入上式可计算出蛋白质的分子量。据。将各种数据代入上式可计算出蛋白质
16、的分子量。 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质的胶体性质 蛋白质溶液是一种分散系统，蛋白质颗粒是分蛋白质溶液是一种分散系统，蛋白质颗粒是分散相，水是散相，水是分散介质。根据分散相的分散程度可以分散介质。根据分散相的分散程度可以把分散系统分为把分散系统分为3类：分散相质点小于类：分散相质点小于1nm的为真的为真溶液；大于溶液；大于100nm的为悬浊液；介于的为悬浊液；介于1100nm之间之间的为胶体溶液的为胶体溶液。 蛋白质的胶体性质 胶体溶液维持稳定要满足胶体溶液维持稳定要满足3个条件：质点大小在个条件：质点大小在1100nm之间；质点带有同种电荷，互相排斥；质之间；质点带有同种电荷，互
17、相排斥；质点能与溶剂形成溶剂化层，质点之间不易聚集。一点能与溶剂形成溶剂化层，质点之间不易聚集。一般情况下，蛋白质溶液满足这些条件。蛋白质溶液般情况下，蛋白质溶液满足这些条件。蛋白质溶液也和其它胶体系统一样，具有丁达尔效应、布朗运也和其它胶体系统一样，具有丁达尔效应、布朗运动以及不能透过半透膜等性质。动以及不能透过半透膜等性质。 蛋白质的沉淀 当破坏蛋白质溶液的稳定条件时，蛋白质会发当破坏蛋白质溶液的稳定条件时，蛋白质会发生沉淀。加入脱水剂除去蛋白质的水化层、改变溶生沉淀。加入脱水剂除去蛋白质的水化层、改变溶液的液的pH达到蛋白质的等电点使其不带同种电荷、加达到蛋白质的等电点使其不带同种电荷、
18、加入电解质破坏蛋白质颗粒的双电层、加热使蛋白质入电解质破坏蛋白质颗粒的双电层、加热使蛋白质变性等都会使蛋白质沉淀。变性等都会使蛋白质沉淀。 蛋白质的沉淀1盐析法盐析法（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）2有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法（甲醇、乙醇、丙酮等）（甲醇、乙醇、丙酮等）3重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等）等）4生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法（鞣酸、苦味酸、（鞣酸、苦味酸、钨酸、钨酸、KI 等，三氯醋酸、磺基水杨酸、硝酸等）等，三氯醋酸、磺基水杨酸、硝酸等） 5加热变性沉淀加热变性沉淀( (少量盐类促进蛋白质加热
19、凝固少量盐类促进蛋白质加热凝固) )四、蛋白质分离纯化的一般原则1前处理前处理：先尽量除去不必要组织和部分，破碎：先尽量除去不必要组织和部分，破碎细胞使蛋白质释放出来，加提取液溶解出蛋白质，细胞使蛋白质释放出来，加提取液溶解出蛋白质，离心得到粗提液。若要提取某细胞器中的蛋白质，离心得到粗提液。若要提取某细胞器中的蛋白质，也可通过差速离心先得到细胞器，再提取。也可通过差速离心先得到细胞器，再提取。2粗分级分离粗分级分离：沉淀法、超滤法。：沉淀法、超滤法。 3纯化纯化：运用各种方法除去杂质。：运用各种方法除去杂质。 不同离心场下沉降的细胞组分相对离心场(g)时间(min)沉降的组分1,0005 真
20、核细胞真核细胞4,00010叶绿体、细胞碎片、细胞核叶绿体、细胞碎片、细胞核15,00020线粒体、细菌线粒体、细菌30,00030溶酶体、细菌细胞碎片溶酶体、细菌细胞碎片100,000310h核糖体核糖体五、蛋白质的分离纯化方法根据分子大小不同的纯化方法透析（透析（dialysis）和超滤（）和超滤（ultrafiltration） 透析透析 超滤超滤磁力搅拌器磁力搅拌器搅拌子搅拌子透析液透析液装有蛋白溶液的透析袋装有蛋白溶液的透析袋根据分子大小不同的纯化方法（密度梯度离心）（密度梯度离心）常用于生成密度梯度常用于生成密度梯度的介质是蔗糖、聚蔗的介质是蔗糖、聚蔗糖（糖（Ficoll），分离核
21、），分离核酸时还常用酸时还常用CsCl作为作为介质。介质。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物柱层析装置图层析介质层析介质（固定相）（固定相）蛋白质样品蛋白质样品流出液流出液洗脱液洗脱液（流动相）（流动相）多孔支持板多孔支持板分离的蛋白质分离的蛋白质根据分子大小不同的纯化方法 凝胶过滤的介质：它们都是化学惰性较强的凝凝胶过滤的介质：它们都是化学惰性较强的凝胶珠，内部是网孔，不同规格的介质有不同大小的胶珠，内部是网孔，不同规格的介质有不同大小的网孔，用于分离不同分子量范围的蛋白质。目前常网孔，用于
22、分离不同分子量范围的蛋白质。目前常用的介质有交联葡聚糖（用的介质有交联葡聚糖（Sephadex G）、聚丙烯酰）、聚丙烯酰胺凝胶（胺凝胶（Bio-Gel P）、琼脂糖（）、琼脂糖（Sepharose或或Bio-Gel A）等。）等。（凝胶过滤层析）（凝胶过滤层析）凝胶过滤层析的原理凝胶过滤层析的洗脱曲线凝胶过滤法测蛋白质的分子量利用溶解度差别的纯化方法( (等电点沉淀等电点沉淀 ) 当把当把pH调到目的蛋白的等电点时，目的蛋调到目的蛋白的等电点时，目的蛋白就会沉淀出来。这样沉淀出来的蛋白质保持白就会沉淀出来。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于具有适当着天然构象，能重新溶解于具有适
23、当pH和一定和一定浓度的缓冲液中。浓度的缓冲液中。 pH和离子强度对乳球蛋白溶解度的影响 随着离子强随着离子强度的增加，溶度的增加，溶解度增加。解度增加。（盐溶作用）（盐溶作用）在在pH5.25.4溶解度最小。溶解度最小。利用溶解度差别的纯化方法( (盐溶和盐析盐溶和盐析 ) 盐溶作用主要是蛋白质分子吸附了盐离子后，盐溶作用主要是蛋白质分子吸附了盐离子后，带电层使蛋白质分子互相排斥，而蛋白质分子与水带电层使蛋白质分子互相排斥，而蛋白质分子与水的相互作用增加，因而溶解度增加。的相互作用增加，因而溶解度增加。 当盐浓度更高时，盐离子夺取蛋白质的水化层当盐浓度更高时，盐离子夺取蛋白质的水化层中的水，
24、破坏蛋白质分子的水化层，使蛋白质分子中的水，破坏蛋白质分子的水化层，使蛋白质分子聚集沉淀。聚集沉淀。 同样浓度的二价离子的盐溶或盐析作用比单价同样浓度的二价离子的盐溶或盐析作用比单价离子更强。离子更强。在等电点时中性盐对一氧化碳血红蛋白溶解度的影响K2SO4iiiZcI221利用溶解度差别的纯化方法（有机溶剂分级分离法）（有机溶剂分级分离法） 常用丙酮作为沉淀蛋白质的溶剂，不同浓度的常用丙酮作为沉淀蛋白质的溶剂，不同浓度的有机溶剂可以沉淀不同种类的蛋白质，沉淀某种蛋有机溶剂可以沉淀不同种类的蛋白质，沉淀某种蛋白质所需的有机溶剂浓度受温度、白质所需的有机溶剂浓度受温度、pH、离子强度、离子强度的
25、影响。的影响。 根据电荷不同的纯化方法( (电泳电泳 ) 带电颗粒在电场中将向与其电性相反的电极移带电颗粒在电场中将向与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。带电颗粒在电场中泳动时，动，这种现象称为电泳。带电颗粒在电场中泳动时，将受到两种方向相反的力的作用。将受到两种方向相反的力的作用。 SUqqEF)(电场力vfFf)(摩擦力 式中，式中，q为颗粒所带的电量，为颗粒所带的电量，E为电场强度，为电场强度，U为两极间的电势差（为两极间的电势差（V），），S为两极间的距离为两极间的距离（cm），），f为摩擦系数，为摩擦系数，v为颗粒的泳动速度为颗粒的泳动速度（cm/s）。其中摩擦系数与颗粒的形状
26、、大小及介）。其中摩擦系数与颗粒的形状、大小及介质的粘度有关。质的粘度有关。根据电荷不同的纯化方法( (电泳）电泳） 当颗粒以恒定速度泳动时，受到的电场力与摩当颗粒以恒定速度泳动时，受到的电场力与摩擦力大小相等，方向相反。即擦力大小相等，方向相反。即vfqE fqEv 在一定的介质中，对于某一种蛋白质在一定的介质中，对于某一种蛋白质来说，来说，q和和f都是定值，因此都是定值，因此v/E也是定值，它被称为电泳迁也是定值，它被称为电泳迁移率。对于某一种蛋白质来说，电场越强，泳动速移率。对于某一种蛋白质来说，电场越强，泳动速度越快。另一方面，不同的蛋白质因度越快。另一方面，不同的蛋白质因q和和f不同
27、，在不同，在同样的电场下泳动速度不同同样的电场下泳动速度不同，经过一段时间的电泳，经过一段时间的电泳就互相分开了。就互相分开了。电泳的介质自由界面电泳：在溶液中进行自由界面电泳：在溶液中进行区带电泳：有支持物，支持物可分为区带电泳：有支持物，支持物可分为4 4类。类。 滤纸电泳和薄膜电泳（醋酸纤维素薄膜、聚滤纸电泳和薄膜电泳（醋酸纤维素薄膜、聚酰胺薄膜）；酰胺薄膜）； 粉末电泳（淀粉、纤维素粉、硅胶粉，粉末粉末电泳（淀粉、纤维素粉、硅胶粉，粉末与适当溶剂调和，铺板）；与适当溶剂调和，铺板）； 细丝电泳，如尼龙丝和其它人造丝电泳，这细丝电泳，如尼龙丝和其它人造丝电泳，这是一类微量电泳；是一类微量
28、电泳； 凝胶电泳，最常用的支持介质是聚丙烯酰胺凝胶电泳，最常用的支持介质是聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。凝胶和琼脂糖凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 以丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成的凝胶以丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成的凝胶作为介质，凝胶中有网孔，通过改变配方可以控制作为介质，凝胶中有网孔，通过改变配方可以控制网孔的大小。不同的蛋白质分子带的电荷不同，受网孔的大小。不同的蛋白质分子带的电荷不同，受到的电场力不同，再加上分子筛效应，不同大小和到的电场力不同，再加上分子筛效应，不同大小和形状的蛋白质在泳动时受到的阻力不同，使得分辨形状的蛋白质在泳动时受到的阻力不同，使得分辨率大大提高。率大大提高。
29、聚丙烯酰胺凝胶丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-N,N-甲叉甲叉双丙烯酰胺双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺平板电泳装置水平式和垂直式平板凝胶电泳装置水平式和垂直式平板凝胶电泳装置我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物平板电泳装置和蛋白质电泳染色结果圆盘电泳装置圆盘电泳槽结构图圆盘电泳槽结构图电泳结果电泳结果圆盘电泳槽圆盘电泳槽俯视图俯视图毛细管电泳装置毛细管电泳原理图毛细管电泳原理图SDS-PAGE测蛋白质的分子量（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis） 十二烷基硫酸钠
30、（十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）是一种去垢剂（表面活性剂），它能与蛋白质结合，是一种去垢剂（表面活性剂），它能与蛋白质结合，使蛋白质变性，解离成亚基，并使蛋白质分子（或使蛋白质变性，解离成亚基，并使蛋白质分子（或亚基）带大量的负电荷，屏蔽了不同蛋白质原有的亚基）带大量的负电荷，屏蔽了不同蛋白质原有的电荷差异，使得不同蛋白质的电泳迁移率仅受分子电荷差异，使得不同蛋白质的电泳迁移率仅受分子量的影响。量的影响。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物SDS-PAG
31、E测蛋白质的分子量 在一定的范围内，蛋白质的泳动距离与其分在一定的范围内，蛋白质的泳动距离与其分子量的对数成反比。根据已知分子量的标准蛋白子量的对数成反比。根据已知分子量的标准蛋白质的泳动距离及其分子量的对数作出标准曲线，质的泳动距离及其分子量的对数作出标准曲线，再测出同样条件下待测分子量蛋白质的泳动距离，再测出同样条件下待测分子量蛋白质的泳动距离，可在标准曲线上查出其分子量。可在标准曲线上查出其分子量。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物SDS-PAGE测蛋白质的分子量等电聚焦 根据蛋白质的等
32、电点不同而把它们分开。介质根据蛋白质的等电点不同而把它们分开。介质中形成中形成一个一个pH梯度，不同等电点的蛋白质最后都停梯度，不同等电点的蛋白质最后都停留在相应留在相应pH处。处。pH梯度的形成有固定梯度和电泳时梯度的形成有固定梯度和电泳时产生梯度两种，后者要在介质中加两性电解质。产生梯度两种，后者要在介质中加两性电解质。 两性电解质商品名为两性电解质商品名为ampholine，它是脂肪族多，它是脂肪族多胺和多羧基类的同系物，它们具有相近但不相同的胺和多羧基类的同系物，它们具有相近但不相同的pKa和和pI值。值。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？
33、但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物等电聚焦双向电泳第一向第一向 等电聚焦等电聚焦第二向第二向 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 （或无（或无SDS）我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物大肠杆菌蛋白质双向电泳染色结果离子交换层析 离子交换剂（离子交换介质）是在惰性的基质离子交换剂（离子交换介质）是在惰性的基质上结合有离子交换基团。常用的基质有纤维素、交上结合有离子交换基团。常用的基质有纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖等；离子交换基团联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂
34、糖等；离子交换基团有阳离子和阴离子两种类型，其中又分为强阳性有阳离子和阴离子两种类型，其中又分为强阳性（酸性）离子交换基团和弱阳性（酸性）离子交换（酸性）离子交换基团和弱阳性（酸性）离子交换基团，及强阴性（碱性）离子交换基团和弱阴性基团，及强阴性（碱性）离子交换基团和弱阴性（碱性）离子交换基团（碱性）离子交换基团。阳离子交换介质阴离子交换介质离子交换层析 蛋白质分子上具有各种阴阳离子基团，在一定蛋白质分子上具有各种阴阳离子基团，在一定的的pH下，蛋白质分子带有净正电荷或净负电荷，下，蛋白质分子带有净正电荷或净负电荷，它们可与离子交换剂上的相应基团进行离子交换它们可与离子交换剂上的相应基团进行离
35、子交换，使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂上。使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂上。改变改变pH和（或）离子强度又可将这些吸附的蛋白和（或）离子强度又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。质洗脱下来。离子交换层析 在一定的上样和洗脱条件下，因不同的蛋白质在一定的上样和洗脱条件下，因不同的蛋白质分子所带的净电荷和电荷密度不同，分子大小也不分子所带的净电荷和电荷密度不同，分子大小也不同，它们与离子交换剂的结合力不同，结合力较弱同，它们与离子交换剂的结合力不同，结合力较弱的先洗脱下来，结合力较强的后洗脱下来，从而达的先洗脱下来，结合力较强的后洗脱下来，从而达到分离的目的。洗脱可分单一溶液洗脱、阶
36、段洗脱到分离的目的。洗脱可分单一溶液洗脱、阶段洗脱和梯度洗脱，既可以改变洗脱液的离子强度，也可和梯度洗脱，既可以改变洗脱液的离子强度，也可以改变以改变pH，也可以两者同时改变。，也可以两者同时改变。 离子交换结合洗脱原理梯度混合器K=VM / VR层析聚焦 用特种多缓冲液用特种多缓冲液（polybuffer）淋洗层析柱中）淋洗层析柱中的特种多缓冲交换剂（的特种多缓冲交换剂（polybuffer exchanger），），就会在柱中产生一个由上而下的就会在柱中产生一个由上而下的pH梯度。随着梯度。随着pH梯度梯度向下移动，达到等电点的蛋白质将顺序被洗向下移动，达到等电点的蛋白质将顺序被洗脱下来。
37、脱下来。 利用选择性吸附的纯化方法1羟基磷灰石层析：羟基磷灰石即结晶磷酸钙羟基磷灰石层析：羟基磷灰石即结晶磷酸钙（Ca10(PO4)6(OH)2），它能吸附蛋白质，加大离子），它能吸附蛋白质，加大离子强度可将蛋白质洗脱下来。强度可将蛋白质洗脱下来。2疏水作用层析：疏水层析介质有丁基琼脂糖、疏水作用层析：疏水层析介质有丁基琼脂糖、苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等，蛋白质分子通过疏水苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等，蛋白质分子通过疏水作用与层析介质结合，通过能减弱疏水作用的洗脱作用与层析介质结合，通过能减弱疏水作用的洗脱液将不同蛋白质分别洗脱下来。液将不同蛋白质分别洗脱下来。 利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方
38、法 将能与目的蛋白特异结合的配体偶联到基质上，将能与目的蛋白特异结合的配体偶联到基质上，在适当的条件下，将蛋白质混合物上样，目的蛋白在适当的条件下，将蛋白质混合物上样，目的蛋白结合在柱中，而杂蛋白直接流出。经洗柱结合在柱中，而杂蛋白直接流出。经洗柱( (washing) )后，换用能减弱目的蛋白与配体结合力的洗脱液，后，换用能减弱目的蛋白与配体结合力的洗脱液，将目的蛋白洗脱将目的蛋白洗脱( (eluting) )。 （亲和层析）（亲和层析）亲和层析原理高效液相层析和快速蛋白质液相层析 分离纯化的原理与柱层析相同，只是用全自分离纯化的原理与柱层析相同，只是用全自动的仪器操作，它们有更高的效率、更
39、高的分辨动的仪器操作，它们有更高的效率、更高的分辨率和更快的过柱速度。率和更快的过柱速度。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物自动部分收集器六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定蛋白质含量测定1双缩脲法双缩脲法 双缩脲试剂：称取双缩脲试剂：称取1.5g CuSO4 5H2O和和6g酒石酸酒石酸钾钠溶于钾钠溶于500ml水中，在不断搅拌下，加入水中，在不断搅拌下，加入300ml 10% NaOH，稀释至，稀释至1000ml。 3ml蛋白质溶液加蛋白质溶液加2ml双缩脲试剂，双缩脲试剂，540nm比色。比色
40、。2紫外吸收法紫外吸收法 280nm比色，测定后蛋白质溶液还能回收。比色，测定后蛋白质溶液还能回收。蛋白质含量测定3Folin-酚法（酚法（Lowry法）法） 蛋白质中的酪氨酸或半胱氨酸，能与蛋白质中的酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比色测定。比色测定。 Folin-酚试剂的配制比较复杂。酚试剂的配制比较复杂。4BCA法法 蛋白质还原蛋白质还原Cu2 +成成Cu+，与，与4,4-二羧基二羧基-2,2-二二喹啉（喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。）形成配合物，显紫色，比色测定。 蛋白质含量测定5 5
41、染料结合法染料结合法 蛋白质能结合考马斯亮兰蛋白质能结合考马斯亮兰G250，显蓝色，显蓝色，595nm比色。比色。 染色液的配制：考马斯亮兰染色液的配制：考马斯亮兰G250 100mg，加，加50ml 95%乙醇（或甲醇）和乙醇（或甲醇）和100ml 85%磷酸，加磷酸，加水至水至1000ml。蛋白质含量测定6 6胶体金测定法胶体金测定法 胶体金是一种带负电荷的疏水胶体，根据颗粒胶体金是一种带负电荷的疏水胶体，根据颗粒大小的不同呈现不同的颜色（从小到大，从桔红色大小的不同呈现不同的颜色（从小到大，从桔红色到紫红色）。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金到紫红色）。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（的是内层负离子（AuC12），外层离子层），外层离子层H+则分散则分散在胶体间溶液中。蛋白质分子可结合在胶体金颗粒在胶体间溶液中。蛋白质分子可结合在胶体金颗粒的外层，使胶体金的颜色转变成蓝色。的外层，使胶体金的颜色转变成蓝色。蛋白质纯度鉴定 各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点，各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点，末端氨基酸测定一种，溶解度曲线单转折点。末端氨基酸测定一种，溶解度曲线单转折点。