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1、高级动物生物化学蛋白质的分离纯化第1页，本讲稿共63页一、分离纯化的意义一、分离纯化的意义从生物材料中分离制备蛋白质，研究其结构与功从生物材料中分离制备蛋白质，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。本质有重大意义。工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。基
2、因工程的需要基因工程的需要第2页，本讲稿共63页二、分离纯化的要求二、分离纯化的要求1 1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。不要求均一。2 2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物
3、活、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。性。3 3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。失。而且提纯步骤越多，损失越大。第3页，本讲稿共63页三、分离纯化的一般程序三、分离纯化的一般程序蛋白质分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段：蛋白质分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段：材料的选择和预处理材料的选择和预处理 破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离其中前两个
4、阶段为分离纯化的前处理。其中前两个阶段为分离纯化的前处理。第4页，本讲稿共63页第二节第二节 蛋白质分离纯化的前处理蛋白质分离纯化的前处理一、材料的选择与预处理一、材料的选择与预处理n选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题，物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。只要能达到实验目的即可。n实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需实验材料选定后，常
5、常需要进行预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。若不立即必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。进行实验或加工，应冷冻保存。第5页，本讲稿共63页二、细胞的破碎二、细胞的破碎n分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持
6、原来的天然状态，不丢生物活性。因此应并保持原来的天然状态，不丢生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。不必进行组织细胞的破碎。第6页，本讲稿共63页n组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。n一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用
7、超声波处理破碎。用超声波处理破碎。n植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。n细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤韧。破碎的方法常有超声波震荡
8、、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。第7页，本讲稿共63页三、细胞器的分离三、细胞器的分离n细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。还有叶绿体。n如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。n细胞器的分离一般采用细胞器
9、的分离一般采用差速离心法差速离心法，即将破碎后的细胞在适当，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。需组分。第8页，本讲稿共63页四、提取四、提取n组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件含物被
10、释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏，这就是物的分解破坏，这就是提取提取。第9页，本讲稿共63页1 1、蛋白质的提取、蛋白质的提取n大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如似生理条件下的缓冲液，如20-50m mol/L20-50m mol/L的磷酸盐的磷酸
11、盐缓冲液（缓冲液（pH7.0-7.5pH7.0-7.5）或）或0.1mol/L Tris-HCl0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0pH7.5-8.0）缓冲液作提取液。）缓冲液作提取液。n对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常多的蛋白质，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。异丙醇、正丁醇等。第10页，本讲稿共63页第三节第三节 分离纯化分离纯化n从细胞中提取得到的蛋白质往往是不纯的，从细胞中
12、提取得到的蛋白质往往是不纯的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一阶段可分为阶段可分为粗分级分离和细分级分离粗分级分离和细分级分离两步进行。两步进行。第11页，本讲稿共63页一、蛋白质的分离纯化一、蛋白质的分离纯化n蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。性质性质 方法方法n分子大小分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤n 溶解度溶解度 等电点沉淀、盐析、有
13、机溶剂沉淀等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀n电荷电荷 电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析n吸附性质吸附性质 吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析）吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析）n对配体分子对配体分子 亲和层析亲和层析 的生物亲和力的生物亲和力第12页，本讲稿共63页n主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。质，又能浓缩蛋白质，但分
14、辨率低。1 1、粗分级分离、粗分级分离第13页，本讲稿共63页（1 1）盐析）盐析l向蛋白质溶液中加入大量的中性盐向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（NHNH4 4)2 2SOSO4 4，NaNa2 2SOSO4 4，使蛋白，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。l盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分
15、子表面的水化层，蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层，使蛋白聚集沉淀。同时盐离子可以中和蛋白质的表面电荷，也促进蛋使蛋白聚集沉淀。同时盐离子可以中和蛋白质的表面电荷，也促进蛋白的沉淀白的沉淀。第14页，本讲稿共63页l 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：白质分别沉淀。如：血清
16、血清球蛋球蛋白白清蛋清蛋白白(NHNH4 4)2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度100%100%饱和饱和析出析出析出析出分段盐析分段盐析第15页，本讲稿共63页第16页，本讲稿共63页（2 2）等电点沉淀）等电点沉淀n蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液有关，随溶液pHpH变化而变化。在溶液变化而变化。在溶液pHpH值等于蛋值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。n不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pHpH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀
17、而与其它蛋到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。白质分开，从而除去大量杂蛋白。第17页，本讲稿共63页（3 3）有机溶剂法）有机溶剂法n与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。n有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个：有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个：n降低水的降低水的介电常数介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。质分子的聚集沉
18、淀。n是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。质分子沉淀。第18页，本讲稿共63页n室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然后在且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。问题。n不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，
19、因此可利用不同浓度的有机溶剂有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。分离不同的蛋白质。第19页，本讲稿共63页2 2、细分级分离、细分级分离n一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率的部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率的柱柱层析及电泳层析及电泳方法。方法。n常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层析、常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析。疏水吸附层析、亲和层析。n常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚
20、焦电泳。电泳。n另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。第20页，本讲稿共63页 酶的活力测定酶的活力测定n在酶的制备过程中，每一步骤都应测定留用以及在酶的制备过程中，每一步骤都应测定留用以及准备弃去部分中所含酶的总活力和比活力，以了准备弃去部分中所含酶的总活力和比活力，以了解经过某一步骤后酶的回收率、纯化倍数，从而解经过某一步骤后酶的回收率、纯化倍数，从而决定这一步的取舍。决定这一步的取舍。n总活力总活力=活力单位活力单位/ml/ml酶液酶液总体积（总体积（mlml）n比活
21、力比活力=总活力单位数总活力单位数/总蛋白（氮）总蛋白（氮）mgmgn纯化倍数纯化倍数=每次比活力每次比活力/第一次比活力第一次比活力n回收率（产率）回收率（产率）=（每次总活力（每次总活力/第一次总活力）第一次总活力）100%100%第21页，本讲稿共63页第三节第三节 纯度鉴定纯度鉴定n生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。n蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-SDS-聚丙聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法、免
22、疫化学法、法、免疫化学法、N-N-末端氨基酸分析法等。末端氨基酸分析法等。n纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度移动，它纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中，应以的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。单一的沉降速度移动。n选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用须同时采用2-32-3种不同的方法才能确定。种不同的方法才能确定。第22页，本讲稿共63页第四节第四节 蛋白质的层析分离蛋白质的层析分离n应用广泛。
23、特征：有一个固定相和一个流动相。由应用广泛。特征：有一个固定相和一个流动相。由于待分离的各种物质在这两个相分配系数不同，当于待分离的各种物质在这两个相分配系数不同，当两个相作相对运动时，这些物质在两相间反复多次两个相作相对运动时，这些物质在两相间反复多次分配，结果使其相互分开。分配，结果使其相互分开。n根据两相的状态，层析法可分为：气相层析和液相根据两相的状态，层析法可分为：气相层析和液相层析；按层析原理可分为：吸附层析、分配层析、层析；按层析原理可分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。按操离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。按操作形式分为：柱层析、薄层层析、纸
24、层析等。作形式分为：柱层析、薄层层析、纸层析等。第23页，本讲稿共63页第24页，本讲稿共63页n 分配系数分配系数:k=C:k=Cs s/C/Cm m,物质在固定相与流动相浓度之比。质物质在固定相与流动相浓度之比。质量分配系数：量分配系数：D=kD=kVs/Vm,Vs,Vm 为固定相和流动相的体为固定相和流动相的体积。积。一、层析的一般原理一、层析的一般原理 3216168816812412412228 如果柱顶加入如果柱顶加入32mg32mg样品，样样品，样品的质量分配系数品的质量分配系数D D为为1 1，即样品，即样品在两相中是等量分配。经过在两相中是等量分配。经过5 5层的层的平衡分配
25、后，样品在柱的分配情平衡分配后，样品在柱的分配情况见图。样品集中在中间。如果况见图。样品集中在中间。如果D1D1D1，样品集中在中间偏下。，样品集中在中间偏下。第25页，本讲稿共63页 离子交换层析离子交换层析(IEX)IEX)是根据电荷来分离分子的。是根据电荷来分离分子的。离离子子交交换换剂剂是是通通过过化化学学反反应应将将解解离离基基团团引引入入到到惰惰性性支支持持物物上上形成的。分为：形成的。分为：阳离子交换剂阳离子交换剂:解离基团带负电解离基团带负电,结合阳离子结合阳离子;阴离子交换剂阴离子交换剂:解离基团带正电解离基团带正电,结合阴离。结合阴离。蛋蛋白白质质分分子子是是两两性性物物质
26、质。当当pHpHpIpI，分分子子带带负负电电，可可结结合合阴阴离离子子交交换换剂剂；当当pHpIpHpI，分分子子带带正正电电，可可结结合合阳阳离离子子交交换换剂剂。如如阳阳离离子子交交换换剂与带正电蛋白质分子之间有如下平衡：剂与带正电蛋白质分子之间有如下平衡：二、离子交换层析二、离子交换层析（一）基本原理（一）基本原理第26页，本讲稿共63页带电蛋白质分子与交换剂的结合是可逆的。带电蛋白质分子与交换剂的结合是可逆的。由于由于pHpH可可改变蛋白质的带电性质和带电量，盐离子会影响蛋白质在交换改变蛋白质的带电性质和带电量，盐离子会影响蛋白质在交换剂上吸附。所以用剂上吸附。所以用一定浓度的盐溶液
27、或一定一定浓度的盐溶液或一定pH 的缓冲液的缓冲液就就可把蛋白质可把蛋白质从离子交换剂上从离子交换剂上洗脱下来。对多组分混合物，每洗脱下来。对多组分混合物，每种分子所带的电荷不同，因此，可用不同的离子强度种分子所带的电荷不同，因此，可用不同的离子强度或不同或不同的的pHpH溶液将蛋白质从交换剂上一一溶液将蛋白质从交换剂上一一洗脱下来。洗脱下来。第27页，本讲稿共63页（二）离子交换剂的基本类型（二）离子交换剂的基本类型 根根据据可可供供交交换换的的离离子子的的性性质质，离离子子交交换换剂剂可可被被分分为为阳阳离离子子交交换换剂剂和和阴阴离离子子交交换换剂剂。若若按按酸酸碱碱性性的的强强弱弱，又
28、又可可分分为为强酸、强碱、弱酸、弱碱几种类型的离子交换剂。强酸、强碱、弱酸、弱碱几种类型的离子交换剂。强强酸酸和和强强碱碱型型交交换换剂剂能能在在较较广广泛泛的的pH范范围围内内（pH212）完完全全解解离离。弱弱酸酸型型交交换换剂剂在在低低于于pH4、弱弱碱碱型型交交换换剂剂在在高高于于pH9就就难难于于解解离离，因因而而失失去去交交换换能能力力。因因为为一一般般蛋蛋白白质质在在pH68之间稳定，所以常用弱酸或弱碱型交换剂。之间稳定，所以常用弱酸或弱碱型交换剂。第28页，本讲稿共63页离子交换基团的结构和性质离子交换基团的结构和性质类型类型名称名称结构式结构式性质性质DEAE二乙基氨基乙基二
29、乙基氨基乙基(diethylaminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)2弱碱性弱碱性QAE季胺乙基季胺乙基(quaternaryaminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)3强碱性强碱性Q季胺季胺(quaternaryamine)-CH2-N+-(CH3)3强碱性强碱性CM羧甲基羧甲基(carboxymehyl)-O-CH2-COO-弱酸性弱酸性SE磺乙基磺乙基(sulfoethyl)-O-CH2CH2-SO3-强酸性强酸性SP磺丙基磺丙基(sulfopropyl)-O-CH2-CH2-CH2-SO3-强酸性强酸性P磷酸基磷酸基(phosphate)-O-
30、PO3-中酸性中酸性S磺酸基磺酸基(sulfonate)-CH2-SO3-强酸性强酸性第29页，本讲稿共63页可可用用来来作作为为交交换换剂剂支支持持物物的的物物质质种种类类较较多多。早早期期用用于于分分离离氨氨基基酸酸、小小肽肽和和其其它它小小分分子子物物质质的的离离子子交交换换树树脂脂的的支支持持物物是是聚聚苯苯乙乙烯类烯类。分分离离蛋蛋白白质质的的常常用用的的亲亲水水性性支支持持物物。有有三三大大类类：纤纤维维素素、葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶(sephadex)、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶(sepharose)和和合合成成凝凝胶胶(Trisacryl和和Fractogel)。1、离子交换纤维素、离子
31、交换纤维素 离离子子交交换换纤纤维维素素是是以以纤纤维维素素做做支支持持介介质质的的。具具有有松松散散的的亲亲水水性性网网络络，较较大大的的表表面面积积，吸吸附附容容量量大大，通通透透性性好好。根根据据离离子子交交换换纤纤维维素素所所含含离离子子交交换换基基团团的的性性质质可可分分为为强强酸酸、强强碱碱型型和和弱弱酸酸、弱碱型。现将常用的离子交换纤维素列于下表中。弱碱型。现将常用的离子交换纤维素列于下表中。第30页，本讲稿共63页常用的离子交换纤维素常用的离子交换纤维素离子类型 解 离 基 团特 点DEAE-OCH2CH2N+(C2H5)在 pH8.6 应用 第31页，本讲稿共63页阴离子阴离
32、子解离基团解离基团交换交换摩尔摩尔(mmol/g)特点特点DEAEOCH2CH2N(C2H5)0.11.1在在pH4应用应用POPO3H20.77.4酸性较强酸性较强SEOCH2CH2SO3H0.20.3强酸性强酸性第33页，本讲稿共63页 在在Sephadex上接上某种离子交换基团。这种凝上接上某种离子交换基团。这种凝胶既有离子交换剂的性质，又有分子筛效应。因此，胶既有离子交换剂的性质，又有分子筛效应。因此，其分离能力比单纯的层析凝胶或离子交换剂好。葡其分离能力比单纯的层析凝胶或离子交换剂好。葡聚糖凝胶离子交换剂的交换量比相应的纤维素离子聚糖凝胶离子交换剂的交换量比相应的纤维素离子交换剂大，
33、如交换剂大，如DEAESephadex的交换量大约是的交换量大约是DEAE纤维素的纤维素的3.55.0倍。倍。2、离子交换葡聚糖凝胶（、离子交换葡聚糖凝胶（Sephadex）第34页，本讲稿共63页葡聚糖凝胶离子交换剂的性质葡聚糖凝胶离子交换剂的性质类别类别离子交换基团离子交换基团床体积床体积ml/g分离范围分离范围(Mr)交换量交换量总交换容量总交换容量(mmol/g)强阳离子交强阳离子交换剂换剂SESephadexC25C50-CH2CH2SO3H5932383104-21053104-21052.02-52.02-5SPSephadexC25C50-CH2CH2CH2SO3H 2.30.
34、3弱阳离子交弱阳离子交换剂换剂CMSephadexC25C50-O-CH2COOH61032403104-21053104-2105 4.50.5第35页，本讲稿共63页强阴离子交换剂强阴离子交换剂QAESephadexA25A505830403104-21053104-21053.04.0弱阴离子交换剂弱阴离子交换剂DEAESephadexA25A50-C2H4N+(C2H5)2H5925833104-21053104-21053.54.5类别类别离子交换基团离子交换基团床体积床体积ml/g分离范围分离范围(Mr)交换量交换量总交换容量总交换容量(mmol/g)-O-C2H4N+(C2H5)
35、2第36页，本讲稿共63页 将各种离子基团引入到交联琼脂糖将各种离子基团引入到交联琼脂糖(Speharose CL)和和大孔合成凝胶大孔合成凝胶(Trisacryl或或Fractogel)上，则形成一系上，则形成一系列离子交换剂。这类交换剂即坚硬、吸附容量大，形列离子交换剂。这类交换剂即坚硬、吸附容量大，形状球形，能维持较好的流速及分辨率。状球形，能维持较好的流速及分辨率。3、交联凝胶离子交换剂、交联凝胶离子交换剂第37页，本讲稿共63页（三）层析条件的选择（三）层析条件的选择1、离子交换剂的选择、离子交换剂的选择 选择离子交换剂之前要了解样品的性质：热稳定选择离子交换剂之前要了解样品的性质：
36、热稳定性、带电情况、性、带电情况、pH和盐浓度对其活性和溶解度的影响。和盐浓度对其活性和溶解度的影响。一般情况下，带负电的物质用阴离子交换剂，反之，一般情况下，带负电的物质用阴离子交换剂，反之，则用阳离子交换剂。实验室中最广泛使用的是则用阳离子交换剂。实验室中最广泛使用的是DEAE和和CM 交换剂。交换剂。2、交换颗粒大小的选择、交换颗粒大小的选择 粒子大小主要影响分辨率和流速。粒子大小主要影响分辨率和流速。粗粒粗粒子：交换容量小、间隙大、分辨率底、流速较子：交换容量小、间隙大、分辨率底、流速较快。快。细粒子：分辨力高、交换容量大但是流细粒子：分辨力高、交换容量大但是流速慢。速慢。第38页，本
37、讲稿共63页3、层析缓冲液的选择、层析缓冲液的选择 选择正确的缓冲液可获得较好的层析效果。因为离子相选择正确的缓冲液可获得较好的层析效果。因为离子相互作用取决于互作用取决于pH，而维持介质的，而维持介质的pH，通常是由缓冲液来实现，通常是由缓冲液来实现的。所用缓冲液的种类、的。所用缓冲液的种类、pH大小，决定大小，决定 待分离组分的稳定性待分离组分的稳定性和溶解度。和溶解度。为避免缓冲液的离子参与离子交换过程，采用缓冲液所带的为避免缓冲液的离子参与离子交换过程，采用缓冲液所带的电荷应与离子交换剂所带电荷相同。使用阳离子交换剂时，要用电荷应与离子交换剂所带电荷相同。使用阳离子交换剂时，要用阴离子
38、型缓冲液（磷酸、醋酸等）；使用阴离子交换剂时要用阳阴离子型缓冲液（磷酸、醋酸等）；使用阴离子交换剂时要用阳离子型缓冲液（离子型缓冲液（Tris、胺盐、吡啶等）。、胺盐、吡啶等）。第39页，本讲稿共63页 要得到好的分离效果，层析时要注意层析柱的高度和体积；要得到好的分离效果，层析时要注意层析柱的高度和体积；上样量的大小；洗脱液体积；洗脱速度；分级物的收集量。上样量的大小；洗脱液体积；洗脱速度；分级物的收集量。1、柱床体积：至少要比结合所有样品所需要的要大、柱床体积：至少要比结合所有样品所需要的要大25倍。离倍。离子交换层析所用的柱不用太长，以便缩短操作时间。子交换层析所用的柱不用太长，以便缩短
39、操作时间。2、样品、样品pH 和离子强度：与起始缓冲液具有相同的和离子强度：与起始缓冲液具有相同的pH和离子强和离子强度。度。3、洗脱液体积和洗脱梯度的形状：对柱的分辨率影响很大。洗脱、洗脱液体积和洗脱梯度的形状：对柱的分辨率影响很大。洗脱可用恒定组成的缓冲液来完成（简单洗脱）也可用改变可用恒定组成的缓冲液来完成（简单洗脱）也可用改变pH或盐或盐浓度，或二者均改变的洗脱液来完成。浓度，或二者均改变的洗脱液来完成。pH和盐浓度的改变和盐浓度的改变又分为连续改变（梯度洗脱）和不连续改变（阶段洗脱）又分为连续改变（梯度洗脱）和不连续改变（阶段洗脱）。（四）柱层析技术（四）柱层析技术第40页，本讲稿共
40、63页 交换剂的处理就是将交换剂转变为适合分离目的的离子类型。交换剂的处理就是将交换剂转变为适合分离目的的离子类型。一般包括除杂质、溶胀，除细粒和改型。改型就是用适当的离子平一般包括除杂质、溶胀，除细粒和改型。改型就是用适当的离子平衡，使交换剂带上希望的离子。阳离子和阴离子交换剂最后分别为衡，使交换剂带上希望的离子。阳离子和阴离子交换剂最后分别为Na和和Cl型是最稳定形式。型是最稳定形式。4、洗脱速度：太快或太慢都会降低柱的分辨率。、洗脱速度：太快或太慢都会降低柱的分辨率。5、分级物收集量：关系到能否充分代表层析柱的分辨率。一般、分级物收集量：关系到能否充分代表层析柱的分辨率。一般总洗脱体积在
41、总洗脱体积在5002000ml时，每管收集时，每管收集510ml（五）离子交换剂的处理和再生（五）离子交换剂的处理和再生 离子交换剂价格较贵，用后再经过再生处理，可反复多次离子交换剂价格较贵，用后再经过再生处理，可反复多次使用。处理时避免用强酸或强碱长时间浸泡，以防载体的糖使用。处理时避免用强酸或强碱长时间浸泡，以防载体的糖链结构遭水解破坏。链结构遭水解破坏。第41页，本讲稿共63页剂剂型型处处理用的酸或碱理用的酸或碱浓浓度度浸泡浸泡时间时间纤维纤维素素SephadexSepharose合成凝胶合成凝胶0.5MHCl或或NaOH(含含0.5MNaCl)0.1MHCl或或NaOH(含含1MNaC
42、l)1MNaAc(pH3.0)或或0.1MNaOH(含含1MNaCl)0.51.0MHCl或或NaOH(含含1MNaCl)34h0.5h可在柱中再生可在柱中再生长时间长时间浸泡无影响浸泡无影响各类离子交换剂的再生条件各类离子交换剂的再生条件第42页，本讲稿共63页 血清蛋白常用离子交换层析分离。血清蛋白常用离子交换层析分离。IgG可用可用QAESephadex A50或或DEAESephadex A50分离。分离。现在临床上有重要用途的许多血清蛋白，如白蛋白，现在临床上有重要用途的许多血清蛋白，如白蛋白，factor IX复合物和专一性免疫球蛋白已用离子交换层复合物和专一性免疫球蛋白已用离子交
43、换层析大规模生产。析大规模生产。（六）离子交换层系的应用实例（六）离子交换层系的应用实例第43页，本讲稿共63页 凝胶层析又称凝胶渗透层析、排阻层析，分子筛层析等。凝胶层析又称凝胶渗透层析、排阻层析，分子筛层析等。它主要用于分离分子大小不同的生物大分子及测定其分子量。它主要用于分离分子大小不同的生物大分子及测定其分子量。凝胶层析设备简单，操作简便，每次层析后无需再生处理，凝胶层析设备简单，操作简便，每次层析后无需再生处理，因此，在生化研究中应用及其广泛。因此，在生化研究中应用及其广泛。三、凝胶过滤层析三、凝胶过滤层析第44页，本讲稿共63页 凝胶层析载体是多孔凝胶。当溶质通过层析柱时，溶质分凝
44、胶层析载体是多孔凝胶。当溶质通过层析柱时，溶质分子不仅是向下运动，而且还在做无定向扩散运动。分子直径比子不仅是向下运动，而且还在做无定向扩散运动。分子直径比凝胶孔径大的分子，不能进入凝胶颗粒的微孔里，只能经过凝凝胶孔径大的分子，不能进入凝胶颗粒的微孔里，只能经过凝胶颗粒之间的孔隙。这样的分子是随溶剂一起移动的，因而最胶颗粒之间的孔隙。这样的分子是随溶剂一起移动的，因而最先流出柱外；而分子直径比凝胶孔径小的分子，则能够自由进先流出柱外；而分子直径比凝胶孔径小的分子，则能够自由进入凝胶颗粒的微孔之中，即进入凝胶相内。小分子向下移动的入凝胶颗粒的微孔之中，即进入凝胶相内。小分子向下移动的速度必然要落
45、后于大分子。凝胶颗粒是固定相，洗脱液是流动速度必然要落后于大分子。凝胶颗粒是固定相，洗脱液是流动相。相。(一一)基本原理基本原理第45页，本讲稿共63页 溶质分子在柱上移动的速度（即被凝胶颗粒阻滞的程度）溶质分子在柱上移动的速度（即被凝胶颗粒阻滞的程度）决定于该分子在两相间的分配常数决定于该分子在两相间的分配常数 Kd。Kd由下式计算：由下式计算：Kd=(Ve-Vo)/Vp 式中式中Ve为某种物质从柱内完全洗脱出来时洗脱液的体积；为某种物质从柱内完全洗脱出来时洗脱液的体积；Vo为胶粒之间空隙的总容积，也称外水体积；为胶粒之间空隙的总容积，也称外水体积；Vp为胶粒内部孔为胶粒内部孔隙的总容积，称
46、内水体积。若分子大，完全不能进入胶粒微隙的总容积，称内水体积。若分子大，完全不能进入胶粒微孔，则最先流出柱，此时孔，则最先流出柱，此时Kd=0；若分子小，能完全进入胶粒；若分子小，能完全进入胶粒微孔，则最微孔，则最 后流出柱，此时后流出柱，此时Kd=1对中等大小的分子，只能部对中等大小的分子，只能部分进入胶粒微孔，所以分进入胶粒微孔，所以Kd值在值在01之间。不同溶质是按之间。不同溶质是按Kd由小由小到大的顺序流出柱。到大的顺序流出柱。第46页，本讲稿共63页 凝胶过滤法的分辨率是凝胶层析中的另一个重要的特征性常数。凝胶过滤法的分辨率是凝胶层析中的另一个重要的特征性常数。从数学概念上考虑，分离
47、分辨率可以表示为：从数学概念上考虑，分离分辨率可以表示为：V1、V2是两种物质的洗脱体积，可以从加样品开始到是两种物质的洗脱体积，可以从加样品开始到洗脱峰的最高点为止的洗脱体积计算。洗脱峰的最高点为止的洗脱体积计算。W1、W2分别为两个物质的洗脱峰的宽度，可以由通过峰边拐分别为两个物质的洗脱峰的宽度，可以由通过峰边拐点的两条切线与基线交点间的距离来计算。两个物质要完全分点的两条切线与基线交点间的距离来计算。两个物质要完全分离，离，必须大于或等于必须大于或等于1。影响分辨率的因素很多，如凝胶粒。影响分辨率的因素很多，如凝胶粒度、上样量、流速、温度、凝胶类型及层析柱的形状等。度、上样量、流速、温度、凝胶类型及层析柱的形状等。=2（V2-V1)W1+W2第47页，本讲稿共63页第48页，本讲稿共63页第49页，本讲稿共63页第50页，本讲稿共63页第51页，本讲稿共63页第52页，本讲稿共63页第53页，本讲稿共63页第54页，本讲稿共63页第55页，本讲稿共63页第56页，本讲稿共63页第57页，本讲稿共63页第58页，本讲稿共63页第59页，本讲稿共63页第60页，本讲稿共63页第61页，本讲稿共63页第62页，本讲稿共63页第63页，本讲稿共63页