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1、ORFORF（Open reading frame)Open reading frame)开放阅读框是基因序列的一部分，包含一段可以编码蛋白的开放阅读框是基因序列的一部分，包含一段可以编码蛋白的碱基序列碱基序列,不能被终止子打断。不能被终止子打断。CDSCDS（coding sequence)coding sequence)序列是编码序列，是用来编码蛋白序列是编码序列，是用来编码蛋白质的那段序列质的那段序列,是是 mRNAmRNA 的一部分的一部分.通常外显子指的是编码蛋白序列通常外显子指的是编码蛋白序列.严格地说，外显子是指保留在初级中不被剪切掉严格地说，外显子是指保留在初级中不被剪切掉的区
2、域的区域,包括包括 55非翻译区(5UTR)、编码序列和非翻译区(5UTR)、编码序列和3非翻译区（3UTR）3非翻译区（3UTR）.所以所以 mRNAmRNA 的外显的外显子的概念应该要大于子的概念应该要大于 CDSCDS 序列的范畴序列的范畴何谓何谓 PCRPCR？PCRPCR 引物设计时有哪些注意事项引物设计时有哪些注意事项（1)1)聚合酶链式反应简称聚合酶链式反应简称 PCRPCR（英文全称：（英文全称：Polymerase Chain Reaction).Polymerase Chain Reaction).（2)PCR2)PCR 引物设计原则引物设计原则1 1 设计的目的是在两个目
3、标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率.引物分析软件将试图通过引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡.设计引用有一些需要注意的基本设计引用有一些需要注意的基本原理：原理：引物长度引物长度 GCGC 含量含量,一般引物序列中一般引物序列中 G+CG+C 含量一般为含量一般为 404060%60%，一对引物的，一对引物的 GCGC 含量和含量和 TmTm 值值应该协调应该协调.若是引物存在严重的若是引物存在严重的 GCGC 倾向或倾向或 ATAT 倾向则可以在引物倾
4、向则可以在引物 55端加适量的端加适量的 A A、T T 或或 G G、C C 尾巴。尾巴。退火温度退火温度退火温度需要比解链温度低退火温度需要比解链温度低 5 5，如果引物碱基数较少，如果引物碱基数较少,可以适当提高退火温度，这样可以可以适当提高退火温度，这样可以使使 PCRPCR 的特异性增加；如果碱基数较多的特异性增加；如果碱基数较多,那么可以适当减低退火温度，是那么可以适当减低退火温度，是 DNADNA 双链结合。双链结合。一对引物的退火温度相差一对引物的退火温度相差 4 46 6不会影响不会影响 PCRPCR 的产率，但是理想情况下一对引物的退的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度
5、是一样的，可以在火温度是一样的，可以在 55557575间变化间变化.避免扩增模板的二级结构区域避免扩增模板的二级结构区域选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构的稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G G）小于）小于 58.6lkJ/mol58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用若不能避开这一区域时，用7 7deaza-2-deaza-2-脱氧脱氧 GT
6、PGTP 取代取代 dGTPdGTP 对对扩增的成功是有帮助的。扩增的成功是有帮助的。与靶与靶 DNADNA 的错配的错配 引物末端引物末端引物引物 3 3端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。33端不应超过端不应超过 3 3 个连续的个连续的 G G或或 C,C,因这样会使引物在因这样会使引物在 G+CG+C 富集序列区错误引发富集序列区错误引发.3.3端也不能有形成任何二级结构可能，端也不能有形成任何二级结构可能，除除在特殊的在特殊的 PCRPCR（ASASPCRPCR）反应中反应中,引物引物 3 3端不能发生错配端不能发生错配.如
7、扩增编码区域如扩增编码区域,引物引物 3 3端不要端不要终止于密码子的第终止于密码子的第 3 3 位，因密码子的第位，因密码子的第 3 3 位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。引物的二级结构引物的二级结构引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于引物自身连续互补碱基不能大于 3bp3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免两
8、引物之间不应该存在互补性，尤应避免 3 3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于况下，一对引物间不应多于 4 4 个连续碱基的同源性或互补性个连续碱基的同源性或互补性.为了下一步操作而产生的不完全匹配5端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5端修饰包括:加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA 序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。PCR 引
9、物设计的黄金法则1.引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如 DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区.2.引物长度一般在 1530 碱基之间。引物长度（primer length）常用的是 1827 bp,但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于 74，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。3。引物 GC 含量在 40%60%之间,Tm 值最好接近 72。GC 含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的
10、GC 含量不能相差太大.另外，上下游引物的 Tm 值（melting temperature)是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下,50寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm 值 510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm 值，则有效引物的 Tm 为 5580，其 Tm 值最好接近 72以使复性条件最佳.4.引物 3端要避开密码子的第 3 位。如扩增编码区域，引物 3端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。5.引物 3端不能选择 A，最好选择 T.引物 3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的
11、碱基为 A 时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于 A、T 之间，所以 3端最好选择 T.6.碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3端不应超过 3 个连续的 G 或 C,因这样会使引物在 GC 富集序列区错误引发。7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpi
12、n）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合.引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免 3 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer 与 Cross dimer)的形成。引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G 值不要过高（应小于4。5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。8。引物 5 端和中间G 值应该相对较高，而 3 端G 值较低。G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G 值越大
13、，则双链越稳定.应当选用 5 端和中间G 值相对较高，而3 端G 值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3 端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。（不同位置的G 值可以用 Oligo6 软件进行分析)9.引物的 5端可以修饰，而 3端不可修饰.引物的 5 端决定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5 端修饰包括：加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从 3 端开始的，不能进行任何修饰.3 端也不能有形成任
14、何二级结构可能。10.扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如 RNAstructure)可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板.实验表明，待扩区域自由能（G）小于 58。6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7deaza2-脱氧GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。11。引物应具有特异性.引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了.值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件
15、比较困难，例如 GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物;用作克隆目的的 PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的.引物设计的要求：1）避免重复碱基，尤其是 G。2）Tm=5860 度.3）GC=30-80%.4)3#39;端最后 5 个碱基内不能有多于 2 个的 G 或 C。5）正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠.6）PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太大,一般在 80250bp 之间都可；8
16、0150 bp 最为合适(可以延长至 300 bp）.7)引物的退火温度要高，一般要在 60 度以上；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组 DNA 污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA 污染的影响。至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS 都应该可以的。做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备寻找合适的引物非常不容易.关于 BLAST 的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在 GENEBANK 中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列,则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用