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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。引物设计注意事项-引物设计注意事项引物设计在基因的相关研究中极其重要，其中自己比较熟悉的一点是基于引物设计的全长cDNA文库的构建。全长cDNA序列的获取是一个十分困难的过程，因此这类数据在GeneBank库中存储较少。在过去的试验中，常见的方法是利用PCR对mRNA序列进行多次扩增，尽可能地获得“全长”的cDNA序列，但是这样的方法很难得到完整的UTR区域。自2000后，发展较迅猛的一个方法是日本一个研究所的“Oligo-capping方法。该方法的过人之处在于：为mRNA的设计了两个不同的引物。在3
2、UTR区域，PolyA信号的存在可以很方便地设计对应的引物，在5UTR区域，该方法用一段寡聚核甘酸代替mRNA的帽子结构，从而很容易地设计出对应的引物。从理论上讲，这种试验方法可以得到100的全长cDNA，但是试验中多种因素的制约，使得该方法得到的cDNA中约有5080%的全长cDNA。如果试验生物学家能够解决这个难题，那么生物信息中对基因组的研究将会有很大的飞跃。汗ing，偶没有做过相关的试验，算是抛砖引玉了，表砸我。基本PCR引物设计参数引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在E
3、B染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物设计时使合成的寡核苷酸链（1824聚物）适用于多种实验
4、条件仍不失为明智之举。引物的二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3末端形成的二聚体，应控制其G大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构，也以3端或近3端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免3末端有发卡结构的引物。引物GC含量和Tm值PCR引物应该保持合理的GC含量。含有50的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大
5、概在5662范围内，这可为有效退火提供足够热度。一对引物的GC含量和Tm值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为降低了Tm值导致特异性的丧失。这种情况下引物Tm值越高，其错误引发的机率也越大。若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。在从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种GC含量和Tm值的协调非常关键。一般来说，一对引物的Tm值相差尽量不超过23摄氏度，同时引物和产物的Tm值也不要相差太大，20摄氏度范围内较好。引物的额外序列与退火温度若有额外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加
6、长的引物。一般说来，引物5端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行4到5个扩增循环；然后在假定引物5端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。在引物上添加限制酶位点时一个重要的考虑是大多数限制酶的有效切割要求在它们的识别序列的5端有2至3个非特异的额外碱基，这样就会增加引物的非模板特异序列的长度。长引物序列的另一个缺点是影响溶解温度的精确计算，而这对于确定PCR反应时的退火温度又是必须的。对于低于20个碱基的引物，Tm值可以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力
7、学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。引物的3末端核苷酸组成引物3末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。如果3末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。引物3末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是在3末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。引物3末端的稳定性由引物3末端的碱基组成决
8、定，一般考虑末端5个碱基的G。此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发。需要注意的是，引物3末端应尽量避免T。实验证明，以T结尾的引物即使与T,G或C错配仍可有效延伸。PCR产物的长度及在耙序列内的位置所有的计算机程序都提供对PCR产物长度范围的选择。一般说来，PCR产物长度对扩增效率有影响。特定的应用情况下，PCR产物长度部分取决于模板材料。预期产物的特定长度经常取决于应用的需要。若目的是建立测定特异DNA片段的临床检验方法，120300bp的小DNA扩增产物可能是最好的。产物应具有好的特异性和高的产生效率，并含有能用于探针捕捉杂交实验的足够
9、信息。这一长度范围的产物可以通过采用两步扩增循环方法得到，从而减少扩增时间。其他PCR方法有不同的最佳产物长度。例如，通过定量的RNA-PCR检测基因表达时，产物应该足够大以便构成竞争性模板，这样，产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来。这些产物一般在250750bp范围内。补充说明若在cDNA序列内找寻PCR引物，需特别注意两点：首先，尽力将引物和产物保持在mRNA的编码区域内，因为这是生成蛋白质的独特序列，不像3末端非编码区域与许多其他mRNA有同源性；第二，尽力把引物放在不同的外显子上，以便使RNA特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。若PCR的目的是克隆一个基因
10、或cDNA的特异序列，产物的大小是根据具体应用预选的。在这里，计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对的信息。在选择用来扩增来自不同物种DNA的引物时，应避开mRNA的5和3末端非翻译区序列，因为它们可能没有任何的同源性。3简并引物设计设计简并引物时，一定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码的简并度。很显然，我们期望选择简并度最低的氨基酸，达到提高特异性的目的。充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。应努力避免3末端的简并，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3末端不要位于密码子的第三位。在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。4测序引物
11、设计当然，测序引物的设计一般都由测序公司来完成，如果需要自己设计的话；那么除了按照上面所提到的引物设计通用标准外，还需要注意两点：测序引物的特异性的标准掌握应该更严格一些，也就是说设计时更优先考虑特异性。因为在测序反应中，如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸，会对结果对来很大的干扰甚至造成结果无法识读。测序引物的Tm值适当高一些。现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA聚合酶来催化，并采用PCR的热循环程序。选用的测序引物的Tm值稍高一些，有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低非特异反应。5探针的设计探针的设计，根据不同的用途各有其设计特点，这里只是就通用的原则进行讨论
12、：探针的长短一般在20-50核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。太短则特异性下降。注意G和C的含量努力控制在40-60，同时一种碱基连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。探针自身序列不能形成二聚体，也不能有“发夹”结构存在，这一点上的要求就要比普通引物设计严格得多。如果探针地靶目标是多个基因的混合物，就必须控制该探针与无关基因之间的相似性在70%以下。PCR中常见问题分析与对策PCR产物的电泳检测时间一般认为PCR产物应在48h以内完成电泳检测，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型就会出现不规则，甚至消失。Troubleshootingguide1假阴性，不
13、出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量，PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因为酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时PCR时忘了加Taq酶或电泳时忘了加溴化乙锭。引物：引物质
14、量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物使用过程中应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二
15、聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20l、30l、50l或100l，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20l后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，否则容易失败。物理原因：温度对PCR扩增来说相当重要。如果变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计
16、，检测一下PCR仪或水浴锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。2假阳性引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外。除了酶及其他不耐高温的物质外，
17、所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。3出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次，是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异
18、条带而另一来源的酶则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时，重新设计引物。减低酶的量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸，也叫两步法)。PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物
19、。一般引物长度为1530碱基，扩增片段长度为100600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3端开始的。这里还需提醒的是3端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。综上
20、所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。产物不能形成二级结构。引物长度一般在1530碱基之间。G+C含量在40%60%之间。碱基要随机分布。引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物5端可以修饰。引物3端不可修饰。引物3端要避开密码子的第3位。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70
21、%或有连续8个互补碱基同源。2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。3.长度寡核苷酸引物长度为1530bp，一般为2027mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74),不能保证产物的特异性。
22、4.G+C含量G+C含量一般为40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。5.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身
23、连续互补碱基不能大于3bp。7.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8.引物的3端引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3端不能发生错配。在标准PCR反应体系中，用2UTaqDNA聚合酶和800mol/LdNTP（四种dNTP各200mol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95，25s；55，25s；72，1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下，引物3端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。AA错配使产量下降至
24、1/20，AG和CC错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。9.引物的5端引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。10.密码子的简并如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方
25、法。关于如何地NCBI验证在文献中查找的引物序列是否正确A：进入blast，在窗口中将找到的序列输进去，点blast，如果序列正确的话得到的结果会显示出基因名称，在全长中的位置，可以根据位置算出大小，如果与文献上的描述吻合，就验证了你找到的引物序列了。B：copy引物序列进入NCBI的BLAST选项，选shortblastpaste引物序列在对话框，点击blast点击新页面的format按钮等待C：shortblast比对单个引物，commonblast可以比对引物对。引物对blast:输入的引物之间用空格或移行隔开；结果显示，正确的靶序列应是plus/plus+plus/minnus，即在同
26、一序列内出现成上下游关系的两个反向引物序列。但是有的引物对的比对结果出乎意料：只找到与其中之一相匹配的序列和位置，另一个就没有了。这种情况多出现在物种间同源序列的引物比对结果和变异速率较快的序列比对结果中。利用BLAST来分析自己设计的引物具体的操作步骤如下：先打开Blast页面http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/然后第一步、点击“Nucleotide”这边的“Searchforshort,nearlyexactmatches”（下图的1所示）。第二步、等页面全部出来以后，将上游引物序列或下游引物序列的互补序列输入或粘贴入“Search”框（下图的2所示，大小写都
27、可以）。如果下游引物序列为5'-GCAAGTCCTTGGACTATGCTGG-3'那它的互补序列为5'-CCAGCATAGTCCAAGGACTTGC-3'。可选择你有搜索的物种或不作任何选择”（下图的3所示）。然后点击“BLAST！”（下图的4所示，页面中间的或页面下端的都可以）。第三步、新页面完全出来以后，点击“Format!”（下图的5所示），会弹出一个新页面，慢慢等待结果全部出来。第四步、从Blast结果中你就可以看到你的引物序列和哪些基因的某段匹配（下图的6所示）及其匹配程度（下图的7所示）了。(Clickthepicturetoseethesource
28、)。当然使用图1中一行的blastn也可以。不过，“Blastn和“Searchforshort,nearlyexactmatches”还是有区别的。BLASTProgramSelectionGuide”是从网上下的，pdf文挡。内容包括：1.CommonBLASTdatabases2.ProgramSelection3.Explanationfortheprogramchoices4.Appendix巢式PCR是指用一对半(三条)或两对引物实现对目的片段的特异性扩增.更精确的来讲,用一对半引物的应该叫做半巢式PCR.其步骤就是,先用一对外侧引物,扩增模板得到包含你想要的目的片段,比你想要的片
29、段更大的区域.然后用另一对内侧引物(即该对引物在第一轮所用的引物的序列内侧),将你第一轮扩增得到的PCR产物为模板,再进行扩增.为了节约引物,可以使用一对半引物.即以第一轮扩增中用到的引物中的一个作为第二轮中的一个引物,与第三条引物分别作为上游和下游引物进行半巢式PCR扩增.进行两轮PCR的目的在于提高扩增的灵敏性.根据文献报道,经巢式PCR扩增后,产物扩增灵敏度较之第一轮能提高10的3次方倍.你想进行结核杆菌的分型实验.需要先从NCBI下载该菌所有的核酸序列.经过比对后,找该菌的保守区,在保守区内设计针对所有结核杆菌的通用引物,作为外侧引物,实现第一轮PCR.再在不同型别的菌间,找其型保守序
30、列,做为特异性引物,即内侧引物再进行第二轮PCR.建议你在将所有结核杆菌的通用引物作为外侧引物的原因在于,减少了你设计和验证引物的工作量,也能把所有的待分型的结核杆菌放在同一个尺度上.用FASTPCR设计简并引物一、从别无选择的蛋白序列设计简并引物，如：M(A/T)ASV(E/D)NR(Q/H/Y)F你只需要用FastPCR的DNA、Protein互转功能即可。1、分析可能的组合，如下（FASTAformat）：1MAASVENRQF2MTASVDNRHF3MTASVDNRYF将以上可能序列粘贴到FastPCR，如下图：(Clickthepicturetoseethesource)二、将蛋白序
31、列转换为DNA序列、结果显示在result.txt中4、综合各简并序列，将各位置的碱基合并，如下：DegenerateDNAatggcngcntcngtngaraaycgncarttyatgacngcntcngtngayaaycgncayttyatgacngcntcngtngayaaycgntaytty综合为：atgacngcntcngtnganaaycgnyantty5、计算简并倍数（DegenerateFold）,本例为：1111141141141141141121142141121310726、适当去除末端碱基，用I代替若干N，减少简并倍数，一般有效简并引物的简并倍数1/MAASVDNR
32、QYARLEPGLNGVVR2/RKGGALNVCFEGSEDLPGG3MMNNCWFRVKTNVCKPHKGEI4ILLREELDGWAEQYPDRLK（/表示设计Leftprimer，表示设计Rightprimer）(Clickthepicturetoseethesource)四、2、选择序列为Protein3、改变PCRprimeroptions（同特异引物设计）4、选择PCR类型，RUN。（同特异引物设计）5、选择质量较高的引物，计算简并倍数（同上）6、用I代替若干N，减少简并倍数。引物设计完成。五、三、介于完全保守于不保守蛋白序列间的简并引物设计可参照以上两种引物的设计方法。转贴第一
33、:引物长度.根据你需要扩增的目的片段长度,你所需引物的长度也不一样,400-500bp需要引物长度的是18-19bp.2-3Kb则需要24-25bp.第二:GC含量.一般掌握在百分之50左右.第三:引物的3端不能有太多的GC,即3端最后五个碱基不能超过一半是G或C.第四:根据你的实验目的,考虑是否需要引入酶切位点.看看楼上的都是转贴，偶发表一下个人的看法。偶在实验室一直帮别人设计引物，估计到现在也设计了上百条了吧，在这里谈谈偶的感想，希望对大家有帮助。1、设计引物首先以“引物设计原则”为据，当然只是参照，也不能一成不变。具体问题要具体分析。2、重点考虑5端和3端引物的退火温度大致相当，GC含量
34、等次考虑之。3、尽量避免多的二聚体和发夹结构的存在，当然，在设计用于表达的引物时加入酶切位点，肯定会使二聚体的产生几率增加，这也无可避免。不要顾虑太多。4、有时为了节省钱，偶经常在一条引物上设计上23个酶切位点，当然这么多酶切位点导致引物自身容易产生二聚体，但是只要引物序列与模板序列特异性较好，这些都不成问题。5、偶经常用primer5设计后，再用OLIGO分析各项指标，尽量使设计的引物各项指标与引物设计原则的要求不会偏离太远。偶也用DNAman来分析两条引物之间可能会形成的二聚体等，最后用在线的软件http:/www.basic.northwestern.edu/biotools/oligo
35、calc作进一步校验。6、完成上述几步，引物就设计完成，然后送去合成。当然，如果批量设计引物，有专门的软件，经常用的一款是http:/frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi。以上拙见，希望能对大家有用转贴引物应用核酸序列保守区内设计并具有特异性。引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源产物不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于58.6lkJ
36、/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。引物长度一般在1530碱基之间。寡核苷酸引物长度为1530bp，一般为2027mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74),不能保证产物的特异性G+C含量在40%60%之间。G+C含量一般为40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则
37、有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳，上下游引物的GC含量不能相差太大。碱基要随机分布。引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp引物之间不能有连续4个碱基的互补。两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或
38、互补性引物5端可以修饰。引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。引物3端不可修饰。引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3端不能发生错配。引物3端要避开MM子的第3位。如扩增编码区域，引物3端不要终止于MM子的第3位，因MM子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先
39、是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据经验，自动搜索功能以“PremierPrimer”为最强且方便使用，“Oligo6”其次，其他软件如“VectorNTISuit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。故认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评
40、价，如此可快速设计出成功率很高的引物。确定引物的另外一种方法（自我体会）：1.查找与研究主题的相关的文章（最好权威杂志），找到使用的引物序列2.验证引物的优劣：a.在pubmed上blast，同时找到基因序列，RNA，DNA，cDNA，CCD，在blast的基础上自己一个一个碱基核对（引物最好跨越外显子和内含子）；b.还可进一步在引物设计软件上评分，意义有限，低分的也可进行的很好。3.去合成就行啦（心中有数）转贴引物延伸实验问题与解答1)什么是引物延伸实验？引物延伸实验用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5-端，确定转录的精确起始。特异的末端标记的
41、引物退火到RNA链的互补区域，随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5末端间的碱基数，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA,长度为20-40个核苷酸，与要分析的转录产物的5末端区域互补。延伸产物小于150个核苷酸，可得到最佳分离效果。引物延伸实验非常灵敏，可检测2pg的转录产物，这相当于1个细胞中的1个RNA。引物延伸实验非常适合于对单个基因作定量和定性分析。2)作这样一个实验必须用什么试剂？引物延伸实验需要模板RNA，可用总RNA或poly(A)+RNA。一个特异的
42、末端标记的核苷酸或DNA片段作为引物，用反转录酶合成cDNA。除RNA模板和标记的引物，还需要反转录酶，AMV或MMLV反转录酶、反应溶液、脱氧核苷酸、聚丙烯酰胺凝胶试剂，和电泳装置。所得结果用放射自显影和磷成像仪分析。3)引物延伸系统中有些什么组分？引物延伸系统中AMV反转录酶和反应溶液、焦磷酸钠、正对照RNA模版和对照引物、去磷酸的PhiX174HinfIDNA标准分子参照物、T4多核苷酸激酶和溶液、样品溶液、AMV反转录酶2X溶液100mMTris-HCl（pH8.3,42oC）、100mMKCl、20mMMgCl2、20mMDTT、2mM每一种dNTP、1mM精胺。PhiX174标准分
43、子参照物和T4多核苷酸激酶用作引物标记，和确定延伸产物长度的标准。对照RNA可得到87个碱基的延伸产物作为正对照。参照技术手册TB113查阅引物延伸系统和AMV反转录酶的其它信息。4)反应中用焦磷酸钠的目的是什么？引物延伸反应中用焦磷酸钠和精胺可增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。虽然其作用方式未确定，但结果是增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。MMLV被焦磷酸钠和精胺抑制，如使用MMLV，放线菌素D可用于增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。焦磷酸钠和放线菌素D抑制cDNA第二条链的合成。5)为成功进行引物延伸实验需对哪些因素作优化？引物延伸实验
44、中所用的杂交温度是最关键的需优化的因素。一般而言，最高紧密度，或引物和互补序列完全杂交所需的最适条件是，低于引物溶解温度的5oC。低于最高紧密度的温度可极大地增加杂交速度。应在不同的紧密度的杂交温度下作杂交，以控制引物和特异RNA的杂交。增加杂交紧密度时，带来的延伸产物的丢失表明，引物和相关的却不是等同的转录产物杂交。在碱和双价阴离子的存在下，RNA在较高温度会降解，应用甲酰胺杂交操作方案，这可有效降低溶解温度，因此可使杂交在较低的温度进行。可在杂交步骤中用以下的溶液：40mMPIPES、1mMEDTA、0.4mMNaCl、80%的甲酰胺。如用这个杂交溶液，延伸步骤前甲酰胺和盐需用乙醇沉淀后除
45、去。模板RNA和引物的量需优化。以下讨论了所用RNA模板和引物的起始量。反转录酶对不同模板使用的效率不同。这部分是由于RNA中存在的次级结构干扰反转录酶的聚合酶活力。如产生短的产物，这通常不是一个问题。如用AMV反转录酶，延伸温度可达55oC。6)每次反应所用RNA的量是多少？每次反应所用RNA和引物的量取决于分析的RNA的种类（总RNA或poly(A)+RNA）,目的RNA的相对丰度。如用总RNA，起始量为10ug，但分析稀有信号，每次反应用100ugRNA。poly(A)+RNA每次反应用0.1-1.0ug，具体决定于总RNA中poly(A)+RNA的富含量，需分析的特异RNA的浓度。在引
46、物延伸分析前需检查目的RNA的完整。通过凝胶分析总RNA，应有完整的18S和28S核糖体RNA带。在引物延伸反应中用Northern印迹和RT-PCR分析来确定特定RNA的存在。7)每次反应所用引物的量是多少？用引物延伸实验定量RNA，标记的引物必须多于目的RNA。引物应是互补RNA的5-10倍。但一般，总RNA或poly(A)+RNA中，特定目的RNA量未知。对未分析的转录物，初次分析用50ug总RNA和100fmol引物。如所有RNA中与引物互补的位点饱和，测试信号和投入的RNA的量成正比，而不依赖于引物的浓度。引物应至少为20个核苷酸，杂交位点应位于转录产物5-末端下游的100个碱基处，
47、而不会自互补。也可用从限制性酶切片段所得的ssDNA作为探针，长度应不长于50-100个核苷酸，以获得最佳分辨率。8)用AMV和MMLV各有哪些优点和缺点？引物延伸反应通常用AMV，AMV性能更好，对次级结构耐受。用AMV的延伸温度可达55oC,以消除次级结构，但在这样温度下，引物延伸反应的得率通常降低。MMLV的最适温度为37oC，在更高温度下，MMLV不稳定，但MMLV可合成更长的产物，这一特点对引物延伸反应不适用，因引物延伸反应所得的产物一般较短，为100-500个核苷酸。9)有哪些因子会导致非特异，短的和多个引物延伸产物？所研究的转录的差异程度可导致产生不同长度的延伸产物，它们来源于选择式剪切和使用不同的转录起始位点。差异核RNA的存在也能导致产生多个延伸产物。引物和RNA中相关或无关序列的交叉杂交也会导致非特异延伸产物的产生。产物短于预测可能和RNA模板的降解有关，或者是转录产物中次级结构阻制了反转录酶的合成，产生断缺的cDNA。RNA样品中存在DNA污染同样可得延伸产物，加放线菌素D（75ug/ml）可抑制这类产物的产生。应作无RNA模板的负对照实验，以确定所用试剂中无RNA和DNA污染。同时还应用从不表达目的转录产物的细胞或组织中提