《DAC是否存在除基因组整合以外影响线粒体功能的作用,分子生物学论文.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DAC是否存在除基因组整合以外影响线粒体功能的作用,分子生物学论文.docx（15页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、DAC是否存在除基因组整合以外影响线粒体功能的作用,分子生物学论文骨髓增生异常综合征，是一种起源于造血干细胞异常克隆的血液系统疾病，主要表现为外周血一系或多系血细胞减少，骨髓活检可见特征性的幼稚前体细胞异常定位病理构造。甲基化转移酶抑制剂，的出现为患者提供了新的治疗策略。 甲基化转移酶 ，是一种维持 甲基化状态的酶，在复制时 能够甲基化修饰新合成的子链 ，使 维持亲本的甲基化状态。地西他滨，作为一种 可通过降解 ，降 低 基 因 组 水 平。 等报道了 能够通过 端的一段信号肽序列定位于线粒体中，与线粒体 结合。线粒体 编码的蛋白介入线粒体氧化呼吸链的电子传递经过，线粒体氧化呼吸复合体功能的异
2、常能够导致线粒体功能的改变。当前国内外有关能否能够通过影响线粒体基因组编码蛋白的表示出，进而改变细胞的功能与状态的研究较少。本研究的目的在于讨论 能否存在除基因组整合以外影响线粒体功能的作用。 材料与方式方法 材料 细胞系 细胞受赠于上海交通大学第六人民医院李晓教授。 主要试剂与仪器 细胞培养用 培养基、胎牛血清分别购于美国 和 公司。 、鼠源 抗体、兔抗鼠二抗、阿非迪霉素购于美国 公司。细胞总提取用 购于美国 公司，反转录试剂盒 为日本 公司产。所用 购于日本公司，实时定量 仪 为瑞士 公司产。检测试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司。 方式方法 细胞培养及细胞周期同步化 细胞系在 、条件下培养
3、于含有青霉素、 链霉素、胎牛血清 培养基中，间隔添加次白介素，每隔传代次。以浓度溶解于 中并保存于 超低温冰箱。将细胞以 个接种在 孔板中，实验组 细胞添加 至浓度为 ，对照组 细胞添加 ，、条件下培养 同步化 细胞。 采用 渗入试验检测细胞周期同步化实验组同步化细胞与阴性对照组细胞，参加终浓度为 的 溴化脱氧尿嘧啶，细胞培养箱中孵育，条件下乙醇固定，将固定后的细胞置于 处理。加抗 抗体室温孵育 。用 标记的兔抗鼠二抗室温孵育 ，重悬于含有 的 中，流式细胞仪 、通道检测 的渗入量。 检测 的产生 将 同步化后的 细胞分别与不同浓度的 作用，实验组 浓度为 、 ，对照组为无 的 ，洗涤细胞 次
4、，将细胞重悬于 无胎牛血清中，细胞培养箱中孵育 ，用 预冷的 缓冲液清洗 次，最后用 缓冲液重悬，采用流式细胞仪 检测。 法检测线粒体 拷贝数及、转录变化 将同步化的 细胞与不同浓度 、 作用 ，实验组 浓度为、 ，对照组为无 的 。采用 法提取细胞总 ，使用 试剂盒将总 逆转率成 ，以 为内参行相对定量 方式方法检测 、基因表示出。 采用 提取试剂盒提取 细胞全基因组 ，检测 的相对拷贝数变化，为内参基因。下面为 所需的引物序列：上游：，下 游：；：上游：，下游：， ：上游：，下 游：；：上游：，下 游：；：上 游：，下游：，总反响体系为 ，反响条件为：， ，不同引物退火温度设定如下：、 ：
5、 ，、：，延伸 ，共 个循环。上述引物扩增片段长度为：，：， ：，：，：。根据各基因检测所得 值，采用 法计算相对基因表示出量。 统计学处理 所得数据采用 统计软件分析。多样本均数比拟采用单因素方差分析，实验组与对照组比拟采用 检验，计量资料以 珋 表示。为差异有统计学意义。 结 果 同步化 细胞检测 将细胞同步化在 期，细胞无法进入 期。由图 可见，实验组经 处理后细胞周期 期几乎无细胞存在，而未加 处理的对照组 细胞根据正常的细胞周期进程，期可见有大量细胞存在。 不同浓度 对同步化 期细胞 产生的影响 见图 。由图 可见，实验组 细胞在 作用后能够促进同步化的 细胞产生 ，与对照组相比差异
6、有统计学意义。当 浓度为 时细胞内 产生较对照组明显较少。 不同浓度 对同步化 细胞线粒体拷贝数及线粒体编码基因 、转录的影响 与对照组相比，同步化 在低浓度、 条件下可促进线粒体 A，拷贝 数 增 加 ，但随着 浓度增加，对 拷贝数影响不大，见图。在高浓度 作用下，同步化 细胞 、基因转录明显增加，而低浓度 对 、的转录影响不大，见图 、。 讨 论 有研究表示清楚，遗传异常在肿瘤发生发展中介入重要的作用。去甲基化药物的出现给 治疗提供了新的策略。地西他滨作为美国批准的两种用于临床的 去甲基化药物之一表现出较好的应用前景，部分 患者从中受益。当前有研究以为，发挥抗肿瘤作用具有浓度依靠性，在低浓
7、度下 主要发挥 去甲基化作用，使发生甲基化沉默的抑癌基因重新表示出，而高浓度 则通过基因组 整合发挥细胞毒作用。 线粒体是一种存在于胞浆内的细胞器，介入多种生物学经过如能量代谢、自由基产生、钙离子平衡、蛋白质转录后修饰、细胞凋亡等。线粒体拷贝数增减或缺失以及线粒体编码基因的突变可见于多种肿瘤组织中，并与肿瘤的发生进展及预后有关。是一种多发于老年患者的血液系统疾病，通过对 患者的线粒体 测序研究表示清楚，高龄 患者线粒体 突变频率增加，且突变多发生于非编码区域。除此之外线粒体编码蛋白的表示出量以及线粒体 的拷贝数增加异常可以见于 患者。 本实验通过体外干涉，使 细胞同步化在 期，抑制 的 整合作
8、用，以此讨论 能否有对细胞发挥非基因组整合依靠的作用。是一种 聚合酶抑制，能够特异性结合 聚合酶，抑制 复制合成进而将细胞周期同步化在 期。本实验结果显示，能够很有效地将细胞同步化在 期。当同步化的 细胞给予不同浓度 作用后发现，在低浓度、 下 可促进同步化细胞产生，但随着浓度的增加，同步化细胞产生的却低于对照组。线粒体内氧化呼吸电子传递是细胞内 主要来源。揣测可能与 改变线粒体功能有关。通过检测不同浓度 对同步化 细胞线粒体 拷贝数以及线粒体基因 、表示出的影响。本实验结果显示，低浓度 、 能够促进线粒体 拷贝数增加，而高浓度 却无此作用。线粒体 复制具有半自主性，且受 聚合酶 催化亚基 ，
9、调控，基因的甲基化程度与线粒体 拷贝数呈负相关。除此之外，有研究发现，在纤维原细胞在遭到内源性或外源性氧化物质刺激后，均可刺激线粒体拷贝数增加。本实验结果显示，当 浓度为 时，能最大程度促进细胞内 产生，而此浓度对线粒体 拷贝数影响并非最明显。由此可见，低浓度 引起的线粒体 拷贝数增加可能与 去甲基化作用有关。随着浓度增加，引起线粒体 损伤，使线粒体拷贝数减少，抵消了 去甲基化作用所致的线粒体 拷贝数增加的作用。因而，在高浓度 作用，同步化 细胞线粒体 拷贝数未见明显改变。虽有研究报道，对线粒体功能有影响，但本实验结果显示，处理组与对照组相比，线粒体 拷贝数无明显的变化。、是已报道的两个线粒体
10、 甲基化转移酶介入调控的线粒体基因。低浓度 对线粒体的 、表示出无明显影响，相比之下，高浓度 能够促进两者的表示出。因氧化呼吸复合体在线粒体内装配异常可影响氧化呼吸链电子传递，所以高浓度 通过改变线粒体基因 、蛋白表示出、氧化呼吸复合物装配异常，进而影响线粒体氧化呼吸电子传递，与对照相比，降低的产生。 综上所述，本研究初步讨论了 存在细胞毒以外的其他作用，不同浓度 能够影响线粒体 的产生，改变线粒体 拷贝数及调节线粒体基因表示出等作用，为深切进入研究 的作用机理提供理念根据。 以下为参考文献： ： ，： ，： ， ，： ， ， ，： ， ，： ，： ：，： ，：，： ， ，： ，： ，：，： ， ，： 靳红，丛雅琴，胡晓静，等骨髓增生异常综合征患者线粒体 区突变研究山东大学学报：医学版，： ， ，： ，：？，： ， ，： ，： ，： ， ，：.