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1、测序的常用方法1 1、末端终止法、末端终止法2 2、化学裂解法、化学裂解法3 3、DNADNA测序自动化测序自动化使用特异性引物使用特异性引物与单链模板与单链模板DNADNA退退火，在火，在DNADNA聚合酶聚合酶作用下进行延伸作用下进行延伸反应，用反应，用ddNTPddNTP终终止，用止，用PAGEPAGE区分区分长度仅相差长度仅相差1 1个核个核苷酸的苷酸的ssDNAssDNA，从，从而完成测序的方而完成测序的方法。法。用化学试剂在用化学试剂在A A、G G、C C、T T处特定的裂处特定的裂解解DNADNA片段，产生一片段，产生一簇各种长度的短链，簇各种长度的短链，经过经过PAGEPAG
2、E放射自显放射自显影可直读影可直读DNADNA顺序。顺序。类似末端终止法，所类似末端终止法，所不同的是用荧光染料不同的是用荧光染料标记，计算机自动读标记，计算机自动读出。出。优点简便、迅速、应简便、迅速、应用广泛。用广泛。不需酶促反应，可不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。以对寡核苷酸测序。1 1、高负荷，、高负荷，1 1块胶可块胶可测测1616个样品；个样品；2 2、机、机读不需放射自显影；读不需放射自显影；3 3、安全不用同位素；、安全不用同位素；4 4、简单迅速。、简单迅速。第1页/共20页第2页/共20页测序过程测序过程:1.1.模板与引物杂交模板与引物杂交2.2.引物的延长和合成阻断引
3、物的延长和合成阻断四个试管分别加入四个试管分别加入 DNADNA聚合酶聚合酶 dNTP dNTP 标记底物标记底物终止剂不同终止剂不同 ddA ddG ddC ddTddA ddG ddC ddT四个试管中所有产物是一系列长度只差一个四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链核苷酸的聚合链3.3.电泳电泳4.4.放射自显影得到直读图象放射自显影得到直读图象第3页/共20页AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53添加 DNA polymerase所有4 dNTPs其中一种标记的ddNTPddTTP ddCTP ddGTP ddATP在四个不同的反应管中各只包含一种ddNT
4、P.第4页/共20页AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53TTCGATTCGATTTCGATTTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGAT reactionC reactionG reactionA reaction每一管中的复制的序列都停留在每一管中的复制的序列都停留在ddNTPs ddNTPs 处处5第5页/共20页第6页/共20页反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离电泳分离.这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基.电泳结构通过显
5、色指示电泳结构通过显色指示.T C G A3CCTTTAGCT5第7页/共20页5.2Maxam-Gilbert化学裂解法化学裂解法 化学裂解化学裂解化学裂解化学裂解法法是是MaxamMaxam和和GilbertGilbert等人等人19771977年创年创建的，用来测定建的，用来测定DNADNA序列。序列。化学法是用化学试剂在化学法是用化学试剂在A A、G G、C C、T T处特定地裂解处特定地裂解DNADNA片段，产生一簇各种片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列长度的短链（等差数列 n=1n=1），经过），经过PAGEPAGE和放射和放射自显影后，可以直接读出自显影后，可以直接读出DNA
6、DNA的顺序。的顺序。第8页/共20页一、化学裂解法测序的原理1 1、用放射性核素标记待测、用放射性核素标记待测DNADNA一侧末端一侧末端2 2、将标记、将标记DNADNA分为分为G G、A+GA+G、C+TC+T、C 4C 4个反应体系个反应体系3 3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂裂DNADNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNADNA片段的混合物片段的混合物4 4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图、电泳分
7、离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出谱，即可读出DNADNA序列序列第9页/共20页碱基特异性修饰及裂解碱基特异性修饰及裂解反应体系反应体系碱基修饰试剂碱基修饰试剂碱基修饰反应碱基修饰反应 主链断裂试剂主链断裂试剂断裂点断裂点G G硫酸二甲酯硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化鸟嘌呤甲基化六氢吡啶六氢吡啶G GG+AG+A甲酸甲酸脱嘌呤作用脱嘌呤作用六氢吡啶六氢吡啶G G和和A AC+TC+T肼肼嘧啶开环嘧啶开环六氢吡啶六氢吡啶C C和和T TC C肼（加盐）肼（加盐）胞嘧啶开环胞嘧啶开环六氢吡啶六氢吡啶C C第10页/共20页化学法读序化学法读序 每组测序图谱为每组测序图谱为4 4条垂直的阶梯带
8、，该片从胶底部一条垂直的阶梯带，该片从胶底部一个个向顶部读，个个向顶部读，G+AG+A和和C+TC+T两列中含有所有相差一个碱基的两列中含有所有相差一个碱基的DNADNA片段。如果片段。如果G+AG+A中出现中出现1 1条带就看条带就看G G列中是否有同样大小列中是否有同样大小的带，若有即为的带，若有即为G G碱基，无则为碱基，无则为A A碱基；同理，碱基；同理，C+TC+T中则检中则检查查C C列中有无同样大小条带，有即为列中有无同样大小条带，有即为C C，无则为，无则为T T。从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为200-300bp200-300bp以内以内第
9、11页/共20页第12页/共20页化学裂解法的特点优点：优点：1 1、所测序列直接来源于所测、所测序列直接来源于所测 DNA DNA，避免了，避免了 DNA DNA 复制中错误复制中错误 dNTP dNTP 的掺入。的掺入。2 2、可直接对合成的寡核苷酸测序，可分析甲、可直接对合成的寡核苷酸测序，可分析甲基化修饰等，以及研究基化修饰等，以及研究 DNA DNA 的二级结构及蛋的二级结构及蛋白质与白质与 DNA DNA 的相互作用等。的相互作用等。缺点：缺点：操作复杂，读序困难。操作复杂，读序困难。第13页/共20页5.3 DNA测序自动化和大规模测序测序自动化和大规模测序特点特点原理同末端终止
10、法原理同末端终止法标记物为荧光染料标记物为荧光染料激光扫描自动测序激光扫描自动测序结果清晰、准确、分辨率高结果清晰、准确、分辨率高测序速度快测序速度快 200bp/h200bp/h第14页/共20页 DNA自动测序与手工测序的不同点1 1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用测序采用4 4种荧光染料分别标记种荧光染料分别标记ddNTPddNTP或标记引物或标记引物2 2、加样方式不同：手工测序，一个样品的、加样方式不同：手工测序，一个样品的4 4个测序反应个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内物分别在不同泳道进
11、行，而自动测序可在一个泳道内电泳，提高电泳分析的效率电泳，提高电泳分析的效率3 3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4 4种寡种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNADNA序列，而自动测序序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑第15页/共20页 DNA DNA序列测定的自动化序列测定的自动化 1.DNA测序步骤与自动化测序步骤与自动化 1）模板制备）模板制备 可自动化可自动化 2）定序反应）定序反应 可自动化可自动化 3）凝胶电泳）凝胶电泳 自动化有一定
12、困难：制胶，点样，电泳，凝胶干自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。燥，放射自显影。4）核苷酸序列阅读与计算机输入）核苷酸序列阅读与计算机输入 可自动化可自动化 2.自动测序仪自动测序仪 Conney等人于等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。做链终止测序，用激光扫描阅读序列。红色红色引物引物+T反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP）黄色黄色引物引物+G反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP）绿色绿色引物引物+A反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNT
13、P+ddATP）兰色兰色引物引物+C反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）第16页/共20页第17页/共20页目前市场上已经有各种型号的目前市场上已经有各种型号的DNADNA自动测序仪可供选购。自动测序仪可供选购。第18页/共20页“分子生物学研究方法分子生物学研究方法”思考题：思考题：1 1、常用的核酸的凝胶电泳是哪两种？它们分辨、常用的核酸的凝胶电泳是哪两种？它们分辨DNADNA片段的范围有何不同？片段的范围有何不同？2 2、电泳操作的基本程序有哪些？、电泳操作的基本程序有哪些？3 3、核酸的分子杂交的概念？、核酸的分子杂交的概念？Southern Southern 印迹法、印迹法、Northern Northern 印迹法和印迹法和Western Western 印迹法的检测对象印迹法的检测对象分别是什么？分别是什么？4 4、什么叫探针（、什么叫探针（Probe)Probe)？5 5、PCRPCR定义？简述聚合酶链式反应的基本原理？定义？简述聚合酶链式反应的基本原理？6 6、核酸、核酸测序的常用方法有哪些？测序的常用方法有哪些？第19页/共20页感谢您的观看。感谢您的观看。第20页/共20页