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1、进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。记忆中的故那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。记忆中的故乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着“怎么这么热怎么这么热”，于是三五成群，聚在大树，于是三五成群，聚在大树下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩
2、子们却在周下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到“强子，别跑了，快来我给你扇扇强子，别跑了，快来我给你扇扇”。孩。孩子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，“你看热的，跑什么？你看热的，跑什么？”此时这把蒲扇，此时这把蒲扇，是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味道！蒲扇是中国传统工艺品，在是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味
3、道！蒲扇是中国传统工艺品，在我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非圆，轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，圆，轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，也走过了我们的半个人
4、生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长也走过了我们的半个人生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长长的时间隧道，袅长的时间隧道，袅1-细胞生物学实验技术前前言言细胞生物学细胞生物学l l英文名称：英文名称：cell biologycell biologyl l定义：从细胞整体、显微、亚显微定义：从细胞整体、显微、亚显微和分子等各级水平上研究细胞结构、和分子等各级水平上研究细胞结构、功能及生命活动规律的学科。功能及生命活动规律的学科。l l发展：细胞生物学由发展：细胞生物学由CytologyCytology发展而来，它是关于细胞结发展而来，它是关于细胞结构与功能构与功能(特
5、别是染色体特别是染色体)的研究。现代细胞生物学从显微的研究。现代细胞生物学从显微水平，超微水平和分子水平等不同层次研究细胞的结构、水平，超微水平和分子水平等不同层次研究细胞的结构、功能及生命活动。功能及生命活动。2023/2/142023/2/142 2细胞生物学发展简史：细胞生物学发展简史：l l三个层次：三个层次：三个层次：三个层次：洋葱表皮细胞显微结构洋葱表皮细胞显微结构骨骼肌超微结构骨骼肌超微结构脱氧核苷酸结构模型脱氧核苷酸结构模型2023/2/142023/2/143 3l l四个阶段：四个阶段：从从16世世纪纪后期到后期到19世世纪纪30年代，是年代，是细细胞胞发现发现和和细细胞知
6、胞知识识的的积积累累阶阶段。段。通通过对过对大量大量动动植物的植物的观观察，人察，人们们逐逐渐渐意意识识到不同的生物都是由形形色色到不同的生物都是由形形色色的的细细胞构成的。胞构成的。第一阶段第一阶段第一阶段第一阶段Robert Robert HookeHooke（1636163617021702），），），），16651665年，他在年，他在年，他在年，他在显显显显微微微微图谱图谱图谱图谱中第一次中第一次中第一次中第一次使用使用使用使用“细细细细胞胞胞胞”一一一一词词词词。Hooke观观察到的察到的软软木木结结构构Hooke使用的使用的显显微微镜镜2023/2/142023/2/144 4
7、从从19世世纪纪30年代到年代到20世世纪纪初期，初期，细细胞学胞学说说形成后，开始了在形成后，开始了在显显微水微水平研究平研究细细胞的胞的结结构与功能。形构与功能。形态态学、胚胎学和染色体知学、胚胎学和染色体知识识的的积积累，使累，使人人们认识们认识了了细细胞在生命活胞在生命活动动中的重要作用。中的重要作用。1893年年Hertwig的的专专著著细细胞与胞与组织组织（Die Zelle und die Gewebe）出版，出版，标标志着志着细细胞学的胞学的诞诞生。生。1896年哥年哥伦伦比比亚亚大学大学Wilson编编著的著的细细胞胞发发育与育与遗传遗传（The Cell in Develo
8、pment and Heredity）、）、1920年墨年墨尔尔本大学本大学Agar编编著的著的细细胞胞学学（Cytology）都是）都是这这一一领领域最早的教科域最早的教科书书。第二阶段第二阶段第二阶段第二阶段2023/2/142023/2/145 5 从从20世世纪纪30年代到年代到70年代，年代，电电子子显显微微镜镜技技术术出出现现后，把后，把细细胞学胞学带带入入了第三大了第三大发发展展时时期，期，这这短短短短40年年间间不不仅发现仅发现了了细细胞的各胞的各类类超微超微结结构，而构，而且也且也认识认识了了细细胞膜、胞膜、线线粒体、叶粒体、叶绿绿体等不同体等不同结结构的功能，使构的功能，使
9、细细胞学胞学发发展展为细为细胞生物学。胞生物学。De Robertis等人等人1924年出版的年出版的普通普通细细胞学胞学（General Cytology）在）在1965年第四版的年第四版的时时候定名候定名为为细细胞生物学胞生物学（Cell Biology），），这这是最早的是最早的细细胞生物学教材之一。胞生物学教材之一。第三阶段第三阶段第三阶段第三阶段线线粒体粒体结结构示意构示意图图线线粒体超微粒体超微结结构构2023/2/142023/2/146 6 从从20世世纪纪70年代基因重年代基因重组组技技术术的出的出现现到当前，到当前，细细胞生物学与分子生胞生物学与分子生物学的物学的结结合愈来
10、愈合愈来愈紧紧密，研究密，研究细细胞的分子胞的分子结结构及其在生命活构及其在生命活动动中的作用中的作用成成为为主要任主要任务务，基因，基因调调控、信号控、信号转导转导、肿肿瘤生物学、瘤生物学、细细胞分化和凋亡是胞分化和凋亡是当代的研究当代的研究热热点。点。第四阶段第四阶段第四阶段第四阶段细细胞凋亡示意胞凋亡示意图图细细胞信号胞信号转导转导途径途径细细胞分化示意胞分化示意图图2023/2/142023/2/147 7细胞生物学学科的发展，细胞生物学学科的发展，正是基于新的研究技术方正是基于新的研究技术方法的建立。法的建立。技术方法技术方法与与科科研思路研思路是学科发展的双翼，是学科发展的双翼，二
11、者缺一不可。二者缺一不可。2023/2/142023/2/148 8细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术学习内容学习内容l l显微镜技术显微镜技术l l细胞结构与成分的显示技术细胞结构与成分的显示技术l l细胞生理生化研究细胞生理生化研究l l细胞培养和分析细胞培养和分析l l细胞膜技术细胞膜技术l l细胞周期分析细胞周期分析l l细胞成分的分离与分析细胞成分的分离与分析l l细胞工程基础技术细胞工程基础技术l l细胞凋亡的测定细胞凋亡的测定l l染色体技术染色体技术l l分子细胞生物学技术分子细胞生物学技术2023/2/142023/2/149 9细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术参考书目
12、参考书目l l章静波章静波章静波章静波,黄东阳黄东阳黄东阳黄东阳,方瑾主编方瑾主编方瑾主编方瑾主编.细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术.化学工业出版社化学工业出版社化学工业出版社化学工业出版社.2006.2006年出版年出版年出版年出版.l l李李李李芬主编芬主编芬主编芬主编.细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术.科学出版社科学出版社科学出版社科学出版社.20072007年出版年出版年出版年出版.l l印莉萍印莉萍印莉萍印莉萍,祁小廷主编祁小廷主编祁小廷主编祁小廷主编.细胞分子生物学技术教程细胞分子生物学技术教程细胞分子
13、生物学技术教程细胞分子生物学技术教程.科学出版社科学出版社科学出版社科学出版社.2001.2001年出版年出版年出版年出版.2023/2/142023/2/141010第一章第一章 显微镜技术显微镜技术l l普通显微镜的构造及使用方法普通显微镜的构造及使用方法普通显微镜的构造及使用方法普通显微镜的构造及使用方法l l相差显微镜的构造及使用方法相差显微镜的构造及使用方法相差显微镜的构造及使用方法相差显微镜的构造及使用方法l l荧光显微镜的构造及使用方法荧光显微镜的构造及使用方法荧光显微镜的构造及使用方法荧光显微镜的构造及使用方法l l激光扫描共聚焦显微镜的构造激光扫描共聚焦显微镜的构造激光扫描共
14、聚焦显微镜的构造激光扫描共聚焦显微镜的构造及使用方法及使用方法及使用方法及使用方法l l透射电子显微镜与超薄切片技透射电子显微镜与超薄切片技透射电子显微镜与超薄切片技透射电子显微镜与超薄切片技术术术术l l扫描电子显微镜与样品制备扫描电子显微镜与样品制备扫描电子显微镜与样品制备扫描电子显微镜与样品制备2023/2/142023/2/141111显微镜分类：显微镜分类：光学光学显微镜：显微镜：可把物体放大可把物体放大1500倍，分辨的最小倍，分辨的最小极限极限为为0.2m。电子电子显微镜：显微镜：2023/2/142023/2/141212用高速用高速电电子束代替光束，放大倍数达子束代替光束，放
15、大倍数达80万倍万倍，分辨率最小极限达，分辨率最小极限达0.10.2nm。电子电子显微镜：显微镜：2023/2/142023/2/141313第一节第一节普通显微镜普通显微镜的构造及使用方法的构造及使用方法2023/2/142023/2/141414显微镜的主要部分是物镜和目镜，显微镜的主要部分是物镜和目镜，显微镜的主要部分是物镜和目镜，显微镜的主要部分是物镜和目镜，为两组焦距较短的凸透镜。为两组焦距较短的凸透镜。为两组焦距较短的凸透镜。为两组焦距较短的凸透镜。一、原理与应用一、原理与应用 物物物物镜镜镜镜的的的的焦焦焦焦距距距距（F1F1）短短短短，目目目目镜镜镜镜的的的的焦焦焦焦距距距距（
16、F2F2）略略略略长长长长。物物物物体体体体ABAB位位位位于于于于物物物物镜镜镜镜的的的的2 2倍倍倍倍焦焦焦焦距距距距和和和和1 1倍倍倍倍焦焦焦焦距距距距之之之之间间间间，所所所所以以以以在在在在物物物物镜镜镜镜的的的的像像像像方方方方形形形形成成成成一一一一个个个个倒倒倒倒立立立立的的的的放放放放大大大大的的的的实实实实像像像像ABAB；ABAB位位位位于于于于目目目目镜镜镜镜的的的的1 1倍倍倍倍焦焦焦焦距距距距以以以以内内内内，经经经经目目目目镜镜镜镜放放放放大大大大为为为为虚虚虚虚像像像像ABAB，ABAB位位位位于于于于人人人人眼眼眼眼的的的的明明明明视视视视距距距距离离离离内
17、内内内。ABAB的的的的视视视视角角角角比比比比眼眼眼眼睛睛睛睛直直直直接接接接看看看看ABAB时时时时视视视视角角角角大大大大得得得得多多多多，所所所所以以以以用用用用显显显显微微微微镜镜镜镜可可可可以以以以看看看看清清清清微微微微小小小小的的的的东东东东西西西西，但但但但人人人人眼眼眼眼通通通通过过过过目目目目镜镜镜镜所所所所看看看看到到到到的的的的是是是是被被被被放放放放大大大大了了了了2 2次次次次的的的的倒倒倒倒立的像。立的像。立的像。立的像。ABABABF2F12023/2/142023/2/141515机械部分机械部分机械部分机械部分照明部分照明部分照明部分照明部分光学部分光学部
18、分光学部分光学部分二、仪器构造二、仪器构造镜座镜座镜柱镜柱镜臂镜臂镜筒镜筒物镜转换器物镜转换器镜台镜台调节器调节器粗准焦螺旋粗准焦螺旋细准焦螺旋细准焦螺旋机械部分机械部分2023/2/142023/2/141616照明部分照明部分反光镜反光镜聚光器聚光器光圈光圈光学部分光学部分目镜目镜物镜物镜2023/2/142023/2/141717（1）目）目镜镜通常通常通常通常备备备备有有有有2323个，上面刻有个，上面刻有个，上面刻有个，上面刻有55、1010或或或或1515符号，符号，符号，符号，表示放大倍数，一般用表示放大倍数，一般用表示放大倍数，一般用表示放大倍数，一般用1010目目目目镜镜镜镜
19、。一般有一般有一般有一般有3434个，上面个，上面个，上面个，上面标标标标有放大倍数和数有放大倍数和数有放大倍数和数有放大倍数和数值值值值孔径（孔径（孔径（孔径（镜镜镜镜口率），如口率），如口率），如口率），如10/0.2510/0.25、40/0.6540/0.65和和和和100/1.3100/1.3；镜镜镜镜筒筒筒筒长长长长度度度度和所要求的盖玻片厚度，如和所要求的盖玻片厚度，如和所要求的盖玻片厚度，如和所要求的盖玻片厚度，如160160（mmmm）/0.17/0.17（mmmm）。）。）。）。（2）物）物镜镜2023/2/142023/2/141818表表表表1-1 1-1 不同倍数物不
20、同倍数物不同倍数物不同倍数物镜镜镜镜的比的比的比的比较较较较镜头镜头放大倍数放大倍数镜镜身身数数值值孔径孔径工作距离工作距离/mm低倍低倍镜镜10短短0.37高倍高倍镜镜40较长较长0.50.5油油镜镜100长长1.30.2不同放大倍数物镜不同放大倍数物镜的工作距离的工作距离2023/2/142023/2/141919（1 1）材料：）材料：）材料：）材料：“a a”字片、字片、字片、字片、红红红红绿绿绿绿羊毛交叉片羊毛交叉片羊毛交叉片羊毛交叉片 人人人人血涂片血涂片血涂片血涂片 双双双双层层层层油油油油镜镜镜镜瓶瓶瓶瓶 擦擦擦擦镜镜镜镜纸纸纸纸（2 2）设备设备设备设备：普通光学：普通光学：
21、普通光学：普通光学显显显显微微微微镜镜镜镜三、实验用品三、实验用品2023/2/142023/2/1420201 1、低倍、低倍、低倍、低倍镜镜镜镜子的使用方法：子的使用方法：子的使用方法：子的使用方法：取取取取镜镜镜镜和放置和放置和放置和放置 对对对对光光光光 放置放置放置放置标标标标本片本片本片本片 调节调节调节调节焦距焦距焦距焦距四、实验操作四、实验操作l看不到物象的可能原因：看不到物象的可能原因：物镜未对正通光孔，对正后再观察；物镜未对正通光孔，对正后再观察；标本未放到视野内，移动标本至通标本未放到视野内，移动标本至通光孔中央；光孔中央；调节器转动太快，超过焦点，应重调节器转动太快，超
22、过焦点，应重新调焦；新调焦；视野内光线太强，不易观察到未染视野内光线太强，不易观察到未染色的标本片，将光线调暗再观察。色的标本片，将光线调暗再观察。2023/2/142023/2/1421212 2、高倍、高倍、高倍、高倍镜镜镜镜的使用方法：的使用方法：的使用方法：的使用方法：选选选选好目好目好目好目标标标标 转换转换转换转换高倍物高倍物高倍物高倍物镜镜镜镜 调节调节调节调节焦距焦距焦距焦距3 3、油、油、油、油镜镜镜镜的使用方法：的使用方法：的使用方法：的使用方法：选选选选好目好目好目好目标标标标 转换转换转换转换油油油油镜镜镜镜 调节调节调节调节光亮光亮光亮光亮 调调调调焦焦焦焦 擦擦擦擦
23、净净净净油油油油镜头镜头镜头镜头和和和和标标标标本片本片本片本片2023/2/142023/2/142222五、注意事项五、注意事项1 1、轻轻轻轻拿拿拿拿轻轻轻轻放，一手握放，一手握放，一手握放，一手握镜镜镜镜臂一手托臂一手托臂一手托臂一手托镜镜镜镜座；座；座；座；2 2、显显显显微微微微镜镜镜镜放放放放稳稳稳稳，镜镜镜镜筒筒筒筒倾倾倾倾斜角度不超斜角度不超斜角度不超斜角度不超过过过过4545；3 3、升、升、升、升镜镜镜镜台、降台、降台、降台、降镜镜镜镜筒、筒、筒、筒、转换转换转换转换物物物物镜时镜时镜时镜时，切勿，切勿，切勿，切勿边边边边操作操作操作操作边观边观边观边观察；察；察；察；4
24、 4、更、更、更、更换标换标换标换标本片本片本片本片时时时时，使，使，使，使镜镜镜镜台与台与台与台与镜头远镜头远镜头远镜头远离，方可取下离，方可取下离，方可取下离，方可取下标标标标本片；本片；本片；本片；5 5、观观观观察部位要察部位要察部位要察部位要对对对对准通光孔中央，不能放反；准通光孔中央，不能放反；准通光孔中央，不能放反；准通光孔中央，不能放反；6 6、转换转换转换转换物物物物镜时应转动转换镜时应转动转换镜时应转动转换镜时应转动转换器，勿手持物器，勿手持物器，勿手持物器，勿手持物镜镜镜镜移移移移动动动动；7 7、用用用用完完完完后后后后使使使使镜镜镜镜头头头头离离离离开开开开通通通通光
25、光光光孔孔孔孔，下下下下降降降降载载载载物物物物台台台台，竖竖竖竖立立立立反反反反光光光光镜镜镜镜，下下下下降降降降聚聚聚聚光光光光器器器器，关关关关闭闭闭闭光圈，玻片移光圈，玻片移光圈，玻片移光圈，玻片移动动动动器回位，放回器回位，放回器回位，放回器回位，放回镜镜镜镜柜内；柜内；柜内；柜内；8 8、保持清、保持清、保持清、保持清洁洁洁洁，勿口吹、手抹或用布擦光学和照明部分。，勿口吹、手抹或用布擦光学和照明部分。，勿口吹、手抹或用布擦光学和照明部分。，勿口吹、手抹或用布擦光学和照明部分。2023/2/142023/2/142323六、实验结果及分析六、实验结果及分析1 1、低低低低倍倍倍倍镜镜
26、镜镜观观观观察察察察“a”a”字字字字片片片片呈呈呈呈倒倒倒倒立立立立的的的的物物物物像像像像，且且且且玻玻玻玻片片片片的的的的移移移移动动动动方方方方向向向向与与与与视视视视野野野野内内内内物物物物像像像像移移移移动动动动的的的的方方方方向相反。向相反。向相反。向相反。2 2、高高高高倍倍倍倍镜镜镜镜观观观观察察察察红红红红绿绿绿绿羊羊羊羊毛毛毛毛交交交交叉叉叉叉片片片片，先先先先在在在在低低低低倍倍倍倍镜镜镜镜下下下下找找找找到到到到羊羊羊羊毛毛毛毛，并并并并将将将将红红红红绿绿绿绿羊羊羊羊毛毛毛毛的的的的交交交交叉叉叉叉点点点点移移移移到到到到视视视视野野野野的的的的中中中中心心心心，然
27、然然然后后后后换换换换高高高高倍倍倍倍镜镜镜镜观观观观察察察察。转转转转动动动动细细细细调调调调节节节节器器器器下下下下降降降降镜镜镜镜台台台台时时时时红红红红色色色色羊羊羊羊毛毛毛毛清清清清晰晰晰晰，表表表表明明明明红红红红色色色色羊羊羊羊毛毛毛毛位位位位于于于于交交交交叉叉叉叉点点点点上上上上方方方方；上上上上升升升升镜镜镜镜台台台台时时时时，绿绿绿绿色色色色羊羊羊羊毛毛毛毛清清清清晰晰晰晰，表表表表明明明明绿绿绿绿色色色色羊羊羊羊毛毛毛毛在在在在交交交交叉点的下方。叉点的下方。叉点的下方。叉点的下方。3 3、低低低低倍倍倍倍镜镜镜镜、高高高高倍倍倍倍镜镜镜镜、油油油油镜镜镜镜观观观观察察
28、察察人人人人血血血血细细细细胞胞胞胞涂涂涂涂片片片片时时时时，观观观观察察察察范范范范围围围围依依依依次次次次变变变变小小小小，放放放放大大大大倍倍倍倍数数数数、分分分分辨辨辨辨率率率率依依依依次次次次提提提提高高高高。血血血血细细细细胞胞胞胞包包包包括括括括红红红红细细细细胞胞胞胞、白白白白细细细细胞胞胞胞和和和和血血血血小小小小板板板板。其其其其中中中中白白白白细细细细胞胞胞胞主主主主要要要要包包包包括括括括淋淋淋淋巴巴巴巴细细细细胞胞胞胞、单单单单核核核核细细细细胞胞胞胞和和和和粒粒粒粒细细细细胞胞胞胞。红红红红细细细细胞胞胞胞为为为为双双双双凹凹凹凹扁扁扁扁盘盘盘盘状状状状,无无无无细
29、细细细胞胞胞胞核核核核，橘橘橘橘红红红红色色色色。白白白白细细细细胞胞胞胞形形形形态态态态不不不不一一一一，细细细细胞胞胞胞核核核核紫紫紫紫色色色色；其其其其中中中中淋淋淋淋巴巴巴巴细细细细胞胞胞胞细细细细胞胞胞胞核核核核大大大大而而而而圆圆圆圆，周周周周围围围围边边边边缘缘缘缘为为为为浅浅浅浅蓝蓝蓝蓝色色色色细细细细胞胞胞胞质质质质；单单单单核核核核细细细细胞胞胞胞，核核核核为为为为马马马马蹄蹄蹄蹄形形形形或或或或肾肾肾肾形形形形，细细细细胞胞胞胞质质质质比比比比例例例例较较较较大大大大浅浅浅浅蓝蓝蓝蓝色色色色；粒粒粒粒细细细细胞胞胞胞核核核核成成成成为为为为叶叶叶叶状状状状，细细细细胞胞胞
30、胞质质质质中具有大小不等的中具有大小不等的中具有大小不等的中具有大小不等的颗颗颗颗粒。血小板粒。血小板粒。血小板粒。血小板为为为为紫紫紫紫红红红红小片状，常多个聚在一起。小片状，常多个聚在一起。小片状，常多个聚在一起。小片状，常多个聚在一起。2023/2/142023/2/142424第二节第二节相差显微镜相差显微镜的构造及使用方法的构造及使用方法2023/2/142023/2/142525一、原理与应用一、原理与应用 光光光光波波波波有有有有振振振振幅幅幅幅(亮亮亮亮度度度度)、波波波波长长长长(颜颜颜颜色色色色)及及及及相相相相位位位位(指指指指在在在在某某某某一一一一时时时时间间间间上上
31、上上光光光光的的的的波波波波动动动动所所所所能能能能达达达达到到到到的的的的位位位位置置置置的的的的不不不不同同同同。光光光光波波波波通通通通过过过过物物物物体体体体时时时时波波波波长长长长和和和和振振振振幅幅幅幅发发发发生生生生变变变变化化化化，人人人人们们们们的的的的眼眼眼眼睛睛睛睛才才才才能能能能观观观观察察察察到到到到，这这这这就是普通就是普通就是普通就是普通显显显显微微微微镜镜镜镜下能下能下能下能够观够观够观够观察到染色察到染色察到染色察到染色标标标标本的道理。本的道理。本的道理。本的道理。活活活活细细细细胞胞胞胞和和和和未未未未经经经经染染染染色色色色的的的的生生生生物物物物标标标
32、标本本本本，波波波波长长长长和和和和振振振振幅幅幅幅并并并并不不不不发发发发生生生生变变变变化化化化，因因因因细细细细胞胞胞胞各各各各部部部部分分分分细细细细微微微微结结结结构构构构的的的的折折折折射射射射率率率率和和和和厚厚厚厚度度度度略略略略有有有有不不不不同同同同，光光光光线线线线透透透透过过过过标标标标本本本本后后后后发发发发生生生生折折折折射射射射，偏偏偏偏离离离离了了了了原原原原来来来来的的的的光光光光路路路路，光光光光波波波波的的的的相相相相位位位位发发发发生生生生变变变变化化化化(相相相相应应应应发发发发生生生生的的的的差差差差异异异异即即即即相相相相差差差差)，而而而而这这这
33、这种种种种微微微微小小小小的的的的变变变变化化化化，人人人人眼眼眼眼无法无法无法无法鉴别鉴别鉴别鉴别，故在普通，故在普通，故在普通，故在普通显显显显微微微微镜镜镜镜下下下下难难难难以以以以观观观观察到。察到。察到。察到。相相相相差差差差显显显显微微微微镜镜镜镜就就就就是是是是将将将将经经经经过过过过透透透透明明明明物物物物体体体体的的的的直直直直射射射射光光光光延延延延迟迟迟迟或或或或提提提提前前前前1/41/4波波波波长长长长，并并并并和和和和绕绕绕绕射射射射光光光光产产产产生生生生干干干干涉涉涉涉，相相相相位位位位差差差差变变变变为为为为振振振振幅幅幅幅差差差差。如如如如果果果果产产产产生
34、生生生的的的的干干干干涉涉涉涉为为为为相相相相长长长长干干干干涉涉涉涉，则则则则振振振振幅幅幅幅的的的的同同同同相相相相量量量量相相相相加加加加而而而而变变变变大大大大，即即即即可可可可看看看看到到到到较较较较亮亮亮亮的的的的部部部部分分分分；如如如如果果果果产产产产生生生生的的的的干干干干涉涉涉涉为为为为相相相相消消消消干干干干涉涉涉涉，则则则则振振振振幅幅幅幅异异异异相相相相量量量量相相相相消消消消而而而而变变变变小小小小，这这这这部部部部分分分分就就就就变变变变得得得得较较较较暗暗暗暗。变变变变相相相相位位位位差差差差为为为为振振振振幅幅幅幅差差差差的的的的结结结结果果果果，使使使使原原
35、原原来来来来透透透透明明明明的的的的物体表物体表物体表物体表现现现现出明出明出明出明显显显显的明暗差异，的明暗差异，的明暗差异，的明暗差异，对对对对比度增加，可清晰比度增加，可清晰比度增加，可清晰比度增加，可清晰观观观观察活察活察活察活细细细细胞的胞的胞的胞的细细细细微微微微结结结结构。构。构。构。2023/2/142023/2/142626 在在在在普普普普通通通通显显显显微微微微镜镜镜镜上上上上增增增增加加加加下下下下列列列列四四四四种种种种附附附附件就成为相差显微镜件就成为相差显微镜件就成为相差显微镜件就成为相差显微镜：环状光阑环状光阑环状光阑环状光阑相差物镜相差物镜相差物镜相差物镜绿色
36、滤光片绿色滤光片绿色滤光片绿色滤光片合轴调整望远镜合轴调整望远镜合轴调整望远镜合轴调整望远镜二、仪器构造二、仪器构造123456相差相差显显微微镜镜光路光路图图示示1-目目镜镜；2-物物镜镜；3-标标本片本片4-聚光器；聚光器；5-相板；相板；6-环环状光状光阑阑2023/2/142023/2/142727环环状光状光阑阑 环环状光状光阑阑位于光源与聚光器之位于光源与聚光器之间间，是，是环环状孔形成的光状孔形成的光阑阑，它，它们们的直的直径和孔径和孔宽宽与不同物与不同物镜镜相匹配。大小不同的相匹配。大小不同的环环状光状光阑阑成一成一转盘转盘。更。更换换放放大率不同的物大率不同的物镜时镜时，要同
37、，要同时时更更换换相相应应的的环环状光状光阑阑。其作用是使照明光。其作用是使照明光线线从从环环状的透明区状的透明区进进入聚光入聚光镜镜，再斜射到，再斜射到标标本上。本上。相差物相差物镜镜(镜头镜头上上标标有有PC或或PH字字样样)物物镜镜的后焦平面上装有相板，相板上和的后焦平面上装有相板，相板上和环环状光状光阑阑相相对应对应的的环环状部分状部分大多数涂有吸收膜和推大多数涂有吸收膜和推迟迟相位膜，其他部分完全透明。从相位膜，其他部分完全透明。从标标本上射本上射过过来的光来的光线线，绕绕射光部分穿射光部分穿过过透明区；直射光透明区；直射光则则穿穿过过相板的相板的环环状部分，状部分，一般所用的相板推
38、一般所用的相板推迟迟相位相位1/4波波长长，吸收，吸收80%的直射光，使直射光和的直射光，使直射光和绕绕射光的射光的强强度接近，明暗反差增大。由于透明度接近，明暗反差增大。由于透明标标本内部构造的折射率本内部构造的折射率不同，不同，产产生生绕绕射光的相位有不同程度的推射光的相位有不同程度的推迟迟，绕绕射光和直射光的干涉射光和直射光的干涉作用将相位差作用将相位差变变成振幅差。成振幅差。2023/2/142023/2/142828绿绿色色滤滤光片光片 在在环环状光状光阑阑下面置下面置绿绿色色滤滤光片于光路中，它可吸收光片于光路中，它可吸收红红色和色和蓝蓝色光，色光，使波使波长长范范围围小的小的单单
39、色光色光线进线进行照明，并有吸行照明，并有吸热热作用，能使相差作用，能使相差观观察察获获得良好的效果。一般得良好的效果。一般选选用中心波用中心波长长546nm的的绿绿色色滤滤光光镜镜，滤滤光光镜镜插入插入后后对对比度就提高。比度就提高。合合轴调轴调整望整望远镜远镜 为为使使环环状光状光阑阑的中心与物的中心与物镜镜的光的光轴轴完全在一直完全在一直线线上，必上，必须须拔出目拔出目镜镜，装上特装上特别别的低倍望的低倍望远镜远镜，使相板的暗，使相板的暗环环与与环环状光状光阑阑的明的明环环重合重合对齐对齐，才能才能发挥发挥相差相差显显微微镜镜的效能。的效能。倒置倒置显显微微镜镜组组成和普通成和普通显显微
40、微镜镜一一样样，只不，只不过过物物镜镜与照明系与照明系统颠统颠倒，物倒，物镜镜安装在安装在载载物台的下方，光源及聚光器安装在物台的下方，光源及聚光器安装在载载物台的上方。物台的上方。倒置相倒置相差差显显微微镜镜用于用于观观察培养瓶或培养板中的活察培养瓶或培养板中的活细细胞的胞的细细微微结结构，由于工作构，由于工作距离的限制，最大放大率距离的限制，最大放大率为为60，一般研究用倒置相差，一般研究用倒置相差显显微微镜镜配置有配置有4、10、20及及40相差物相差物镜镜。2023/2/142023/2/142929（1 1）材料：体外培养）材料：体外培养）材料：体外培养）材料：体外培养细细细细胞；胞
41、；胞；胞；（2 2）设备设备设备设备：相差：相差：相差：相差显显显显微微微微镜镜镜镜。三、实验用品三、实验用品1 1、倒置相差、倒置相差、倒置相差、倒置相差显显显显微微微微镜镜镜镜的使用方法：的使用方法：的使用方法：的使用方法：(1)(1)打开开关，将打开开关，将打开开关，将打开开关，将标标标标本置于本置于本置于本置于载载载载物台上；物台上；物台上；物台上；(2)(2)转转转转动动动动环环环环状状状状光光光光阑阑阑阑转转转转盘盘盘盘，使使使使普普普普通通通通光光光光阑阑阑阑进进进进入入入入光光光光路路路路，并并并并将将将将光光光光圈圈圈圈开开开开到到到到最最最最大大大大。旋旋旋旋转转转转物物物
42、物镜镜镜镜转转转转换换换换器器器器，使使使使低低低低倍倍倍倍相相相相差差差差物物物物镜镜镜镜进进进进入入入入光光光光路路路路，对对对对光光光光和和和和调调调调焦，看焦，看焦，看焦，看见标见标见标见标本。本。本。本。四、实验操作四、实验操作2023/2/142023/2/143030(3)(3)转转转转动动动动转转转转换换换换器器器器，使使使使相相相相差差差差物物物物镜镜镜镜(20)(20)对对对对准准准准标标标标本本本本，同同同同时时时时转转转转动动动动环环环环状状状状光光光光阑阑阑阑转转转转盘盘盘盘选选选选用用用用2020标标标标示示示示孔孔孔孔的的的的光光光光阑阑阑阑，以以以以使使使使环环
43、环环状状状状光光光光阑阑阑阑的的的的直直直直径径径径和和和和孔孔孔孔宽宽宽宽与与与与所所所所使使使使用用用用的的的的相相相相差差差差物物物物镜镜镜镜相相相相适适适适应应应应，用用用用细细细细调调调调节节节节器器器器调调调调节节节节焦焦焦焦距距距距，使使使使物物物物像像像像清楚。清楚。清楚。清楚。(4)(4)合合合合轴轴轴轴调调调调节节节节。将将将将合合合合轴轴轴轴望望望望远远远远镜镜镜镜换换换换入入入入目目目目镜镜镜镜筒筒筒筒内内内内，一一一一边边边边向向向向望望望望远远远远镜镜镜镜内内内内观观观观察察察察，一一一一边边边边用用用用右右右右手手手手转转转转动动动动望望望望远远远远镜镜镜镜内内内
44、内筒筒筒筒使使使使其其其其下下下下降降降降，当当当当对对对对准准准准焦焦焦焦点点点点就就就就能能能能看看看看到到到到环环环环状状状状光光光光阑阑阑阑的的的的亮亮亮亮环环环环和和和和相相相相板板板板的的的的黑黑黑黑环环环环，将将将将望望望望远远远远镜镜镜镜固固固固定定定定，升升升升降降降降聚聚聚聚光光光光器器器器并并并并调调调调节节节节其其其其下下下下的的的的螺螺螺螺旋旋旋旋使使使使亮亮亮亮环环环环的的的的大大大大小小小小与与与与黑黑黑黑环环环环一一一一致致致致，然然然然后后后后前前前前后左右后左右后左右后左右调节环调节环调节环调节环状光状光状光状光阑阑阑阑聚光器上的聚光器上的聚光器上的聚光器上
45、的调节钮调节钮调节钮调节钮，使两，使两，使两，使两环环环环完全重合。完全重合。完全重合。完全重合。2023/2/142023/2/143131五、注意事项五、注意事项1 1、载载载载玻玻玻玻片片片片或或或或培培培培养养养养瓶瓶瓶瓶必必必必须须须须平平平平整整整整、均均均均匀匀匀匀，标标标标本本本本不不不不能能能能太太太太厚厚厚厚，否否否否则则则则相差相差相差相差显显显显微微微微镜镜镜镜成像效果不好；成像效果不好；成像效果不好；成像效果不好；2 2、标标标标本本本本要要要要在在在在有有有有水水水水的的的的环环环环境境境境中中中中（如如如如培培培培养养养养液液液液或或或或用用用用水水水水封封封封片
46、片片片）成成成成像像像像效效效效果才明果才明果才明果才明显显显显。六、实验结果与分析六、实验结果与分析 在在在在倒倒倒倒置置置置相相相相差差差差显显显显微微微微镜镜镜镜下下下下观观观观察察察察活活活活细细细细胞胞胞胞，可可可可清清清清楚楚楚楚地地地地分分分分辨辨辨辨细细细细胞胞胞胞的的的的内内内内部部部部结结结结构构构构，细细细细胞胞胞胞边边边边界界界界、细细细细胞胞胞胞核核核核、核核核核仁仁仁仁以以以以及及及及胞胞胞胞质质质质中中中中存存存存在在在在的的的的颗颗颗颗粒粒粒粒状状状状结结结结构清晰可构清晰可构清晰可构清晰可见见见见，分裂期，分裂期，分裂期，分裂期细细细细胞可胞可胞可胞可见见见见
47、期染色体。期染色体。期染色体。期染色体。2023/2/142023/2/143232第三节第三节荧光显微镜荧光显微镜的构造及使用方法的构造及使用方法2023/2/142023/2/143333一、原理与应用一、原理与应用1 1、荧荧荧荧光的光的光的光的产产产产生生生生 一一一一些些些些化化化化学学学学物物物物质质质质经经经经短短短短波波波波高高高高能能能能光光光光激激激激发发发发后后后后能能能能吸吸吸吸收收收收并并并并储储储储存存存存能能能能量量量量而而而而进进进进入入入入激激激激发发发发态态态态，当当当当其其其其从从从从激激激激发发发发态态态态再再再再回回回回复复复复到到到到基基基基态态态态
48、时时时时，过过过过剩剩剩剩的的的的能能能能量量量量以以以以荧荧荧荧光光光光的的的的形形形形式式式式发发发发射射射射。荧荧荧荧光光光光发发发发射射射射的的的的特特特特点点点点是是是是在在在在接接接接受受受受能能能能量量量量后后后后即即即即刻刻刻刻引引引引起起起起发发发发光光光光，而而而而一一一一旦旦旦旦停停停停止止止止供供供供能能能能荧荧荧荧光光光光现现现现象象象象随随随随之之之之瞬瞬瞬瞬间间间间消消消消失失失失。各各各各种种种种荧荧荧荧光光光光分分分分子子子子有有有有其其其其特特特特定定定定的的的的吸吸吸吸收收收收光光光光谱谱谱谱；光光光光谱谱谱谱(荧荧荧荧光光光光光光光光谱谱谱谱)，即即即即
49、在在在在某某某某一一一一特特特特定定定定波波波波长长长长处处处处有有有有最最最最大大大大吸吸吸吸收收收收峰峰峰峰和和和和最最最最大大大大发发发发射射射射峰峰峰峰，因因因因此此此此要要要要观观观观察察察察不不不不同同同同的的的的荧荧荧荧光光光光应应应应选选选选用不同波用不同波用不同波用不同波长长长长的激的激的激的激发发发发光，得到的光，得到的光，得到的光，得到的荧荧荧荧光光光光强强强强度才能最大。度才能最大。度才能最大。度才能最大。2023/2/142023/2/143434 有有有有些些些些物物物物质质质质能能能能够够够够自自自自发发发发荧荧荧荧光光光光，如如如如维维维维生生生生素素素素A A
50、的的的的红红红红色色色色荧荧荧荧光光光光、胶胶胶胶原原原原纤纤纤纤维维维维的的的的蓝蓝蓝蓝绿绿绿绿色色色色荧荧荧荧光光光光、绿绿绿绿色色色色荧荧荧荧光光光光蛋蛋蛋蛋白白白白(GFP)(GFP)的的的的绿绿绿绿色色色色荧荧荧荧光光光光；有有有有些些些些物物物物质质质质不不不不能能能能够够够够自自自自发发发发荧荧荧荧光光光光，用用用用荧荧荧荧光染料染色后，光染料染色后，光染料染色后，光染料染色后，结结结结合物可合物可合物可合物可发发发发出出出出荧荧荧荧光。光。光。光。荧荧光染料光染料激激发发光光荧荧光光颜颜色色应应用范用范围围溴化乙溴化乙锭锭（EB）蓝蓝紫紫红红DNAHO33258紫外紫外蓝蓝白白