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1、细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术主讲：龚曼曼基础医学院科研中心本章内容提要本章内容提要第一节第一节 显微技术显微技术第二节第二节 生物化学与分子生物学技术生物化学与分子生物学技术第三节第三节 细胞分离技术细胞分离技术第四节第四节 细胞培养与细胞杂交细胞培养与细胞杂交Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green淀粉 1952年年Nomarski发明，利用发明，利用两组平面偏振光的干涉，加两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率
2、差别更可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。大，故影像的立体感更强。 物镜与照明系统颠倒；物镜与照明系统颠倒； 用于观察培养的活细胞，用于观察培养的活细胞，通常具有相差或通常具有相差或DIC物物镜，有的还具有荧光装镜，有的还具有荧光装置。置。 采用组合方式，集普采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、通光镜、相差、荧光、暗视野、暗视野、DIC、摄影、摄影装置于一体；装置于一体； 自动化与电子化自动化与电子化。 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长与以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长与加速电压加速电压(通常通常50120KV)的平方根成反比；的平方根成反比； 由电子照明系统、电
3、磁透镜成像系统、真空系统、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等记录系统、电源系统等5部分构成；部分构成； 分辨力分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍；，放大倍数可达百万倍； 用于观察超微结构（小于用于观察超微结构（小于0.2m）。）。TEM LIGHT PATHWAYTRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM 1）超薄切片 超薄切片厚度仅50nm左右，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。 用重金属盐用重金属盐(如
4、磷钨如磷钨酸酸) 染色；吸去染料染色；吸去染料干燥后，样品凹陷干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属处铺了一层重金属盐，而凸的出地方盐，而凸的出地方没有染料沉积，从没有染料沉积，从而出现负染效果，而出现负染效果，分辨力可达分辨力可达1.5nm左右。左右。Negative Stained Archaebacteria 20世纪世纪60年代问世，用来观察标本表面结构；年代问世，用来观察标本表面结构； 分辨力为分辨力为610nm，因人眼的分辨力（区别荧光，因人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描，扫描电镜的有效放大倍率为电镜的有效放大倍率为0.2
5、mm/10nm=20000X。 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次要喷涂上一层重金属膜，重金属在电
6、子束的轰击下发出次级电子信号。级电子信号。人类红细胞人类红细胞酵母酵母转基因显微操作过程 组织化学和细胞化学染色方法用于对某些组织化学和细胞化学染色方法用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。细胞成分进行定性和定位研究。（一）固定（一）固定1. 物理固定：血膜空气干燥、冷冻干燥。物理固定：血膜空气干燥、冷冻干燥。2. 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。1.金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最金属沉淀法
7、：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成终生成CoS或或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。有色沉淀，而显示出酶活性。2.Schiff反应：醛基可使反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。反应）。3.联苯胺反应：过氧化酶分解联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。4.脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。5.
8、茚三酮反应：显示蛋白质。茚三酮反应：显示蛋白质。 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。使乳胶感光。 一般用一般用14C和和3H标记。常用标记。常用3H-TDR来显示来显示DNA，用，用3H-UDR显示显示RNA；用；用3H氨基
9、酸研究蛋白质，用氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。岩藻糖研究多糖。14C半衰期为半衰期为5730年，年，3H为为12.5年。年。 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。核苷酸序列间是否具有互补关系。 （一）原位杂交（一）原位杂交（in situ hybridization）。）。 用于检测染色体上
10、的特殊用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。探针，后来又发明了免疫探针法。人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 是体外分析特异是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核制性内切酶将核DNA或线粒体或线粒体DNA切成切成DNA片段，片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。针互补的特殊核苷序列。 将将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则
11、称为转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。杂交。 PCR即：即：polymerase chain reaction。 反应体系：样品反应体系：样品DNA；引物（；引物（primer），约），约15-20个个核苷酸；核苷酸；4种种dNTP；Tag DNA聚合酶，来自于嗜热聚合酶，来自于嗜热水生菌水生菌Thermus aquaticus，最适作用温度，最适作用温度7580，短时间在短时间在95下不失活。缓冲体系和下不失活。缓冲体系和Mg2+。 反应过程：变性：约反应过程：变性：约90-95；复性：约；复性：约60左右；左右；延伸：延伸：70-75；重复；重复 “变性变性复性复性延伸
12、延伸” 过程过程20-30次循环。次循环。Low speedHigh speedDifferential centrifugation（二）密度梯度离心（二）密度梯度离心 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可
13、根据这些性质分选出高纯度机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。）。细胞系名称细胞系名称细胞类型细胞类型来源来源3T3成纤维细胞成纤维细胞小鼠小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞宫颈癌上皮细胞Henrietta Lacks BHK21成纤维细胞成纤维细胞叙利亚仓鼠叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞上皮细胞袋鼠袋鼠L6成肌细胞成肌细胞大鼠大鼠PCI2嗜铬细胞嗜铬细胞大鼠大鼠SP2浆细胞浆细胞小鼠小鼠SP20骨髓瘤浆细胞骨髓瘤浆细胞小鼠小鼠CHO卵巢细胞卵巢细胞中国地鼠中国地鼠Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 HAT:hypoxanthine，aminopterin，thymidine