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1、一、实验目的一、实验目的1.1.熟悉并理解细胞膜熟悉并理解细胞膜选择透性选择透性这一细这一细胞基本生理活动。胞基本生理活动。2.2.了解各类物质进入细胞的速度。了解各类物质进入细胞的速度。实验四实验四 细胞膜的渗透性细胞膜的渗透性二、实验原理二、实验原理细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构，细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构，它可选择性地让某些物质进出细胞。而对于不它可选择性地让某些物质进出细胞。而对于不同性质的物质，细胞膜的通透性是大不一样的。同性质的物质，细胞膜的通透性是大不一样的。当细胞与所处的环境存在渗透压差别时，水分当细胞与所处的环境存在渗透压差别时，水分子可从渗透压低的一
2、侧向高的一侧扩散，以至子可从渗透压低的一侧向高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，细胞会失水而皱缩；而在低于在高渗环境中，细胞会失水而皱缩；而在低渗环境中，细胞会吸水膨胀直至破裂。渗环境中，细胞会吸水膨胀直至破裂。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。溶血溶血（hemolysishemolysis）:红细胞破裂，血红红细胞破裂，血红蛋白逸出称红细胞溶解，简称溶血。蛋白逸出称红细胞溶解，简称溶血。三、实验用品三、实验用品（一）仪器（一）仪器50ml50ml烧杯烧杯10ml10ml移液管移液管试管试管（二）试剂（二）试剂0.17mol/L0.17mol/L氯化钠氯
3、化钠 0.17mol/L0.17mol/L氯化铵氯化铵0.17mol/L0.17mol/L醋酸铵醋酸铵 0.17mol/L0.17mol/L硝酸钠硝酸钠0.12mol/L0.12mol/L草酸铵草酸铵 0.12mol/L0.12mol/L硫酸钠硫酸钠0.32mol/L0.32mol/L葡萄糖葡萄糖 0.32mol/L0.32mol/L甘油甘油0.32mol/L0.32mol/L乙醇乙醇 0.32mol/L0.32mol/L丙醇丙醇（三）材料（三）材料鸡红细胞悬液鸡红细胞悬液 四、实验步骤四、实验步骤（一）鸡红细胞悬液（一）鸡红细胞悬液 取取50ml50ml小烧杯一只，加入鸡血小烧杯一只，加入鸡
4、血1 1份份（1ml1ml）和）和1010（10ml10ml）份）份0.17mol/L 0.17mol/L 氯氯化钠溶液，形成一种不透明的红色液化钠溶液，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的鸡血。体，此即稀释的鸡血。（二）低渗溶液（二）低渗溶液 取试管一支加入取试管一支加入10ml10ml蒸馏水，然后蒸馏水，然后再加入再加入1ml1ml稀释的鸡血，注意观察溶液稀释的鸡血，注意观察溶液的颜色变化，由不透明的红色逐渐澄的颜色变化，由不透明的红色逐渐澄清，红细胞发生破裂，造成清，红细胞发生破裂，造成100%100%红细红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。胞溶血，使光线比较容易透过溶液。（三）鸡红细胞
5、的渗透性（三）鸡红细胞的渗透性1.1.取试管一支加入取试管一支加入0.17mol/L0.17mol/L氯化钠溶氯化钠溶液液10ml10ml，再加入，再加入1ml1ml稀释的鸡血，轻稀释的鸡血，轻轻摇动，注意是否有颜色变化？是轻摇动，注意是否有颜色变化？是否有溶血现象？为什么？否有溶血现象？为什么？2.2.取试管一支加入取试管一支加入0.17mol/L0.17mol/L氯化铵溶液氯化铵溶液10ml10ml，再加入，再加入1ml1ml稀释的鸡血，轻轻摇动，稀释的鸡血，轻轻摇动，注意是否有颜色变化？是否有溶血现象注意是否有颜色变化？是否有溶血现象？若发生溶血，记下时间（自加入？若发生溶血，记下时间（
6、自加入1ml1ml稀稀释鸡血到溶液变成红色透明澄清所需时释鸡血到溶液变成红色透明澄清所需时间。间。3.3.分别在下列等渗溶液中进行实验，步骤同分别在下列等渗溶液中进行实验，步骤同2 2。五、实验结果五、实验结果将观察到的现象记录，并进行分析、比较：将观察到的现象记录，并进行分析、比较：1.试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（），镜检红细胞层红色不透明为不溶血（），镜检红细胞完好呈双凹盘状。完好呈双凹盘状。2.如果试管内液体混浊，上层带红色者，称如果试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（或），镜检有部分红细不完全溶血（或），镜检有部
7、分红细胞呈碎片。胞呈碎片。3.如果试管内液体变红而透明者，称完全溶如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血（），镜检发现细胞全部呈碎片。血（），镜检发现细胞全部呈碎片。六、实验报告书写实验报告，并就细胞膜对不同物质的渗透性不同，对实验结果进行分析见表。书写实验报告，并就细胞膜对不同物质的渗透性不同，对实验结果进行分析见表。目测法判断标准：快速溶血：；慢速溶血：或；不溶血：目测法判断标准：快速溶血：；慢速溶血：或；不溶血：七、问题七、问题1、为什么我们检查细胞膜渗透性的试剂、为什么我们检查细胞膜渗透性的试剂是一定浓度的，如：是一定浓度的，如：0.17mol/L0.17mol/L的氯化钠，的氯化钠，
8、为什么设定为这个浓度？为什么设定为这个浓度？2 2、解释快速溶血的原因，乙醇和丙醇。、解释快速溶血的原因，乙醇和丙醇。实验五实验五 宫颈癌宫颈癌HeLaHeLa细胞培养细胞培养一、一、细胞培养技术细胞培养技术1.体内培养体内培养(in vivo culture):体内培养技术最大限度地模仿了活体结构的自然生长环境。体内培养技术最大限度地模仿了活体结构的自然生长环境。最常见的体内培养方式就是移植最常见的体内培养方式就是移植(transplantation)。2.体外培养体外培养(in vitro culture):按结构成分分为细胞培养按结构成分分为细胞培养(cell culture)组织培养组
9、织培养(tissue culture)器官培养器官培养(organ culture)。3.细胞株细胞株(系系)与克隆与克隆二、细胞培养定义：二、细胞培养定义：1.1.原原代代培培养养 （primary primary cultureculture）：从从动动物物机机体体取取出出的的进进行行培培养养的的细细胞胞群群。原原代代培培养养的的细细胞胞生生长长比比较较缓缓慢慢，而而且且繁繁殖殖一一定定的的代代数数后后（一一般般1010代代以以内内）停停止止生生长长，需要从更换培养基。需要从更换培养基。2.2.传传代代培培养养(subculture):(subculture):培培养养细细胞胞的的生生存存
10、环环境境是是瓶瓶皿皿或或其其他他容容器器，生生存存空空间间和和营营养养是是有有限限的的，当当细细胞胞增增殖殖到到一一定定密密度度后后，需需要要分分离离出出一一部部分分细细胞胞并并更更新新营营养养液液，这这一一过过程程称称为为传传代代。将将细细胞胞从从一一个个培培养养瓶瓶转转移移到到另另外外一个培养瓶即称为传代或传代培养（一个培养瓶即称为传代或传代培养（PassagePassage）。）。3.3.细胞株（细胞株（cell straincell strain）：从原代培养细胞群中筛选出）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖5050代
11、左右，代左右，在培养过程中其特征始终保持。在培养过程中其特征始终保持。4 4.细胞克隆细胞克隆(cell cloning)(cell cloning)：从一个单一母细胞繁殖出来：从一个单一母细胞繁殖出来的细胞群体，细胞克隆方法包括：稀释铺板法、饲养层的细胞群体，细胞克隆方法包括：稀释铺板法、饲养层克隆法、琼脂克隆法等克隆法、琼脂克隆法等。三、三、细胞培养技术的基本概念细胞培养技术的基本概念（一）动物细胞培养（一）动物细胞培养另一种分类方式将细胞培养方式大致可分为两种：另一种分类方式将细胞培养方式大致可分为两种：一种是群体培养（一种是群体培养（mass culturemass culture），
12、将含有一定数量细胞的悬液置），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluenceconfluence）后形成均匀的）后形成均匀的单细胞层单细胞层（贴壁培养）（贴壁培养）；另一种是克隆培养（另一种是克隆培养（clonalclonal culture culture），将高度稀释的游离细胞悬），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（cloneclone）。一个细
13、胞克）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。此外，为了制取细胞产品而设计了转鼓培养法，使用大容量的圆培此外，为了制取细胞产品而设计了转鼓培养法，使用大容量的圆培养瓶，在培养过程中不断地转动，使培养的细胞始终处于悬浮状态养瓶，在培养过程中不断地转动，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中而不贴壁。之中而不贴壁。群体培养（左）和克隆培养（右）目前实验室中常用的几种细胞目前实验室中常用的几种细胞系系 细胞系细胞系 名称细胞类型名称细胞类型 来源来源 3T3 成纤维细胞 小鼠 HeLa 宫颈癌上皮细胞 人 BHK21 成纤维细胞 叙利亚仓鼠 PtKl 上皮细
14、胞 袋鼠 L6 成肌细胞 大鼠 PCI2 嗜铬细胞 大鼠 SP2 浆细胞 小鼠 SP20 骨髓瘤浆细胞 小鼠 CHO 卵巢细胞 中国地鼠动物细胞的培养步骤：动物细胞的培养步骤：切取拟培养的动物器官或大组织块切取拟培养的动物器官或大组织块洗去血污洗去血污剔除多余成分剔除多余成分切成约切成约1mm3大小的组织块大小的组织块将所有组织剪碎将所有组织剪碎用于组织培养用于组织培养蛋白酶溶液消化蛋白酶溶液消化机械方法吹打组织块机械方法吹打组织块离心、培养液悬浮离心、培养液悬浮计数、调节细胞密度计数、调节细胞密度用于分离细胞培养用于分离细胞培养细胞培养所使用的仪器：细胞培养所使用的仪器：实验内容安排实验内容
15、安排一、细胞培养准备工作（清洗）一、细胞培养准备工作（清洗）二、细胞培养准备工作（消毒、灭菌）二、细胞培养准备工作（消毒、灭菌）三、三、培养基的配制培养基的配制四、四、细胞传代培养细胞传代培养五、五、死活细胞的鉴别死活细胞的鉴别一、实验目的一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。的使用方法。二、实验原理二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中
16、工作量最大，也是最基本的步骤。织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。养不好与清洗不彻底有很大关系。灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。行。三、实验
17、内容三、实验内容每一组同学准备两个细胞培养瓶每一组同学准备两个细胞培养瓶每二组配制一份洗液。每二组配制一份洗液。清洗二氧化碳培养箱，灭菌。清洗二氧化碳培养箱，灭菌。四、仪器、材料和试剂四、仪器、材料和试剂（一）仪器（一）仪器超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器（二）材料（二）材料紫外灯、微孔滤膜（直径紫外灯、微孔滤膜（直径25mm25mm）：孔径为）：孔径为0.22um0.22um(三）试剂三）试剂75%75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOHNaOH等等五、实验步骤五、实验步骤（一）清洗（一）清洗1.1.新玻璃器皿的清洗新玻璃器皿的清洗
18、先用自来水刷洗，再浸泡先用自来水刷洗，再浸泡5%5%稀盐酸中和玻璃表面的碱稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。性物质和有害物质。2.2.使用过的玻璃器皿的清洗使用过的玻璃器皿的清洗（1 1）立即进入清水，避免干涸难洗；）立即进入清水，避免干涸难洗；（2 2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥；干燥；（3 3）浸酸性洗液过夜；）浸酸性洗液过夜；（4 4）从洗液捞出自来水冲洗）从洗液捞出自来水冲洗10101515次去除酸性洗液，蒸馏水次去除酸性洗液，蒸馏水刷洗刷洗3 3次，倒置烘干；次，倒置烘干；（5 5）包装（牛皮纸或不透水纸）
19、；）包装（牛皮纸或不透水纸）；（6 6）高压（）高压（1515磅磅20min)20min)或干热（或干热（160160度度2h)2h)灭菌；灭菌；（7 7）备用。）备用。（二）（二）TipTip和和TubeTube的清洗的清洗（1 1）新的国产）新的国产TipTip和和TubeTube如用于非如用于非RNARNA提取时提取时可用蒸馏水刷洗，晾干，高压灭菌后使用。可用蒸馏水刷洗，晾干，高压灭菌后使用。（2 2）使用过的）使用过的TipTip和和TubeTube用后浸泡在用后浸泡在0.2mol/L 0.2mol/L NaOHNaOH或或0.2mol/L 0.2mol/L HClHCl溶液中，清水溶
20、液中，清水洗过，自来水清洗洗过，自来水清洗1010次晾干，进洗液次晾干，进洗液2 224h24h。晾干，放入饭盒高压灭菌，备用。晾干，放入饭盒高压灭菌，备用。（三）洗液的配制（三）洗液的配制常用的洗液是硫酸常用的洗液是硫酸-重铬酸钾溶液。洗液可根据需要配制不重铬酸钾溶液。洗液可根据需要配制不同的浓度同的浓度（每每4 4个同学配制个同学配制120ml120ml强洗液：重铬酸钾强洗液：重铬酸钾6.3g6.3g、浓、浓硫酸硫酸100ml100ml、蒸馏水、蒸馏水20ml20ml）成分成分强酸洗液强酸洗液次强酸洗液次强酸洗液重铬酸重铬酸钾钾63g63g3150g3150g120g120g6000g60
21、00g浓硫酸浓硫酸1 000ml1 000ml50 000ml50 000ml200ml200ml10 000ml10 000ml蒸馏水蒸馏水200ml200ml10 000ml10 000ml1 000ml1 000ml50 000ml50 000ml配制方法：配制方法：（1 1）将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放）将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。溶解。（2 2）将重铬酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓）将重铬酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分溶解。硫酸并用一长玻璃棒不断搅
22、拌，充分溶解。注意：操作时注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，注意：操作时注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液飞溅到衣物皮肤上，不慎飞溅到皮肤应防止洗液飞溅到衣物皮肤上，不慎飞溅到皮肤应立即用大量清水冲洗。立即用大量清水冲洗。（四）消毒和灭菌（四）消毒和灭菌（1 1）射线消毒灭菌）射线消毒灭菌主要使用主要使用X X、60Co60Co进行消毒灭菌，用于牛血清或进行消毒灭菌，用于牛血清或塑料制品。塑料制品。（2 2）紫外线消毒）紫外线消毒一般用无臭氧型紫外灯。一般一般用无臭氧型紫外灯。一般20min20min，71%71%细菌消细菌消灭；灭；40min40min后后79%79%细菌消灭，细菌消灭，
23、60min60min后后86%86%细菌消灭。细菌消灭。紫外线照射时间照射再长也不能紫外线照射时间照射再长也不能100%100%灭菌，最多灭菌，最多只能达到只能达到90%90%。（3 3）干热灭菌）干热灭菌主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放入干燥箱内，加热至器皿放入干燥箱内，加热至160160度，保温度，保温90120min90120min。用于。用于RNARNA提取实验的用品则需要提取实验的用品则需要180180度，保温度，保温58h.58h.（4 4）湿热灭菌）湿热灭菌也称高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。也称高压蒸汽灭菌，是最有效的
24、一种灭菌方法。主要应用布类、橡胶、金属器械、玻璃器皿、主要应用布类、橡胶、金属器械、玻璃器皿、塑料以及加热后不发生沉淀的无机溶液。塑料以及加热后不发生沉淀的无机溶液。（5 5）滤过灭菌）滤过灭菌用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液。用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液。（七）化学消毒法（七）化学消毒法（1 1）70%70%（75%75%）酒精消毒）酒精消毒（2 2）0.1%0.1%新洁尔灭消毒新洁尔灭消毒（3 3）来苏儿水消毒）来苏儿水消毒（4 4）0.5%0.5%过氧乙酸消毒过氧乙酸消毒（5 5）乳酸蒸汽消毒）乳酸蒸汽消毒（6 6）37%37%甲醛加高锰酸钾消毒甲醛加高锰酸钾消毒（7 7）煮
25、沸消毒）煮沸消毒实验五实验五 宫颈癌宫颈癌HeLaHeLa细胞株培养细胞株培养二、培养基的配制二、培养基的配制二、实验原理二、实验原理组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养
26、活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子、激素、贴附因子等，是合成培养基所无法因子、激素、贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。一、实验目的一、实验目的熟练掌握熟练掌握RPMI 1640RPMI 1640培养基的配制方法。培养基的配制方法。三、仪器、材料和试剂三、仪器、材料和试剂超净工作台超净工作台微孔过滤器（微孔过滤器（0.22um0.22um）高压灭菌锅高压灭菌锅蒸馏水器蒸馏水器磁力搅拌器磁力搅拌器天平天平超低温冰箱超低温冰箱二氧化碳
27、培养箱二氧化碳培养箱（一）仪器（一）仪器（二）用具、材料（二）用具、材料细胞培养瓶细胞培养瓶微量加样器微量加样器250ml250ml和和125ml125ml试剂瓶、量筒、离心管试剂瓶、量筒、离心管pHpH试纸试纸培养细胞培养细胞（三）试剂（三）试剂HClHCl、NaOHNaOH、酚红酚红RPMI 1640RPMI 1640干粉干粉小牛血清、青霉素、链霉素小牛血清、青霉素、链霉素、L-L-谷氨酰谷氨酰胺胺NaHCONaHCO3 3、胰酶、胰酶三蒸水三蒸水四、实验步骤四、实验步骤（一）准备（一）准备(清洗与灭菌）清洗与灭菌）（二）（二）合成培养基（合成培养基（RPMI 1640 RPMI 1640
28、）的配制的配制 配制配制100ml RPMI 1640100ml RPMI 1640母液：母液：1 1、每、每4 4小组合称小组合称RPMI 1640RPMI 1640干粉干粉 1.04g1.04g，溶于，溶于100ml100ml的的3DW3DW。2 2、置于搅拌器上搅拌、置于搅拌器上搅拌4040分钟，直到液分钟，直到液体变为澄清为止。体变为澄清为止。3 3、通入、通入COCO2 2，使液体变为金黄色，说，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。明培养基完全溶好。4 4、溶好以后置于超净台中进行、溶好以后置于超净台中进行0.22um0.22um滤过除菌，分装至试剂瓶中。滤过除菌，分装至试剂瓶中。
29、5 5、瓶口封好，、瓶口封好，-20-20或或44贮存。贮存。（三）小牛血清的处理（三）小牛血清的处理新买的新生小牛血清一定要灭活；新买的新生小牛血清一定要灭活；将新生小牛血清不开封置于将新生小牛血清不开封置于5656水水浴锅中浴锅中30min,30min,期间要不时轻轻晃动，期间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。使受热均匀，防止沉淀析出。已灭活的血清贮存于已灭活的血清贮存于4 4。（四）生长培养基的配制（四）生长培养基的配制1 1双抗：（双抗：（100000u/ml100000u/ml）160160万单位青霉素万单位青霉素/瓶瓶+8ml 3DW=20+8ml 3DW=20万单位万单位
30、/ml/ml1g1g链霉素链霉素+5ml 3DW=200000ug/ml+5ml 3DW=200000ug/ml各取以上的液体各取以上的液体5ml5ml混合，使其浓度为混合，使其浓度为1010万单位万单位/ml/ml，0.22um0.22um过滤至过滤至1.5ml1.5ml离心管，离心管，-20-20贮存。贮存。2 2谷氨酰胺储备液（谷氨酰胺储备液（200mM200mM）：1.5g1.5g的谷氨酰胺溶于的谷氨酰胺溶于50ml3DW50ml3DW中中（30mg/ml=200mM),0.22um30mg/ml=200mM),0.22um过滤至过滤至1.5ml1.5ml离心管离心管中。中。-20-2
31、0贮存。贮存。注：注：200mM=200mmol/L200mM=200mmol/L（毫摩尔每升（毫摩尔每升)3.3.饱和饱和NaHCONaHCO3 3的配制的配制每组称取每组称取10g10g的的NaHCONaHCO3 3溶于溶于200ml 3DW 200ml 3DW 中，过滤除菌后分装于中，过滤除菌后分装于50ml50ml试剂瓶。试剂瓶。4 4保存保存4.RPMI 16404.RPMI 1640生长培养基的配制生长培养基的配制5050毫升毫升储备液浓储备液浓度度终浓度终浓度RPMI 1640RPMI 1640培养培养液液 4444谷氨酰胺谷氨酰胺0.50.530mg/ml30mg/ml0.3m
32、g/ml0.3mg/ml双抗双抗0.050.05100000u/m100000u/ml l100u/ml100u/ml小牛血清小牛血清5 510%10%NaHCO3调调pH至至7.0七、思考题：七、思考题：血清在细胞培养中有何作用？血清在细胞培养中有何作用？为什么配制培养基之前要反复处理配制用为什么配制培养基之前要反复处理配制用水并要事先高压处理？水并要事先高压处理？配制培养基时调节配制培养基时调节pHpH值的目的是什么？值的目的是什么？六、实验报告六、实验报告写出各自配制试剂的步骤。写出各自配制试剂的步骤。叙述配制过程中所观察到的现象。叙述配制过程中所观察到的现象。一、实验目的一、实验目的熟
33、练掌握细胞传代培养的操作方法。熟练掌握细胞传代培养的操作方法。观察外培细胞在不同时期的形态变化及观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。生长状况。实验五实验五 宫颈癌宫颈癌HeLaHeLa细胞株培养细胞株培养三、细胞传代培养三、细胞传代培养二、实验原理二、实验原理贴壁细胞指的是体外培养条件下，必须贴附贴壁细胞指的是体外培养条件下，必须贴附于支持物表面才能生长的细胞，贴壁后一般于支持物表面才能生长的细胞，贴壁后一般呈纤维样细胞或上皮样细胞两种形态。贴壁呈纤维样细胞或上皮样细胞两种形态。贴壁细胞在培养瓶长成致密单层厚，继续生长的细胞在培养瓶长成致密单层厚，继续生长的空间不足，培养基中的营养成分
34、也消耗较多，空间不足，培养基中的营养成分也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需进行分瓶培同时代谢废物也有较多堆积，需进行分瓶培养，对细胞进行传代扩增。养，对细胞进行传代扩增。对于贴壁不太紧的细胞如对于贴壁不太紧的细胞如colo320，可以直，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如HeLa、colo205贴壁细胞，则需要以细胞消贴壁细胞，则需要以细胞消化液消化后才能脱落和分散。化液消化后才能脱落和分散。常用的消化液为胰蛋白酶。常用的消化液为胰蛋白酶。胰酶消化的原理：胰酶是一种蛋白酶，通过特定位置上降解蛋白，使细胞膜上和培养瓶壁结合处蛋白降解，致使两者分离
35、。这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力作用下成为球形。细胞消化用胰蛋白酶常用的工作液浓度为0.25%，PH为7.2-7.4之间。胰酶消化的程度是一个关键：消化过度会对细胞活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失，甚至造成细胞破碎；消化不足则细胞难于从瓶壁吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。一般消化时间为1至3分钟，肉眼观察瓶壁由半透明转为点状透明时，弃去胰酶，并加入适量的有血清培养液终止消化，吹打分散。三、仪器、材料和试剂三、仪器、材料和试剂超净工作台超净工作台 微量加样器（移微量加样器（移液枪）液枪）倒置显微镜倒置显微镜 高压灭菌锅高压灭菌锅蒸馏水器蒸馏水器 超低温冰
36、箱超低温冰箱二氧化碳培养箱二氧化碳培养箱（一）仪器（一）仪器（二）用具、材料（二）用具、材料细胞培养瓶细胞培养瓶滴管滴管培养细胞培养细胞四、实验步骤四、实验步骤1.RPMI 16401.RPMI 1640生长培养基的配制生长培养基的配制5050毫升毫升储备液浓储备液浓度度终浓度终浓度RPMI 1640RPMI 1640培养培养液液 4444谷氨酰胺谷氨酰胺0.50.530mg/ml30mg/ml0.3mg/ml0.3mg/ml双抗双抗0.050.05100000u/m100000u/ml l100u/ml100u/ml小牛血清小牛血清5 510%10%NaHCO3调调pH至至7.02、传代培养
37、步骤（以下均为无菌、传代培养步骤（以下均为无菌操作）操作）从培养箱中取出原代培养细胞并置于超净工作台，弃去培养液，加入0.6ml的0.25%胰酶溶液，以使细胞贴壁面充分浸润，当见到细胞贴壁面的瓶壁出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量培养液终止消化，吹打分散。细胞计数：取细胞计数：取5ul细胞悬浮液加入等量台盼细胞悬浮液加入等量台盼蓝染液，混匀后用血球计数板计算细胞的成蓝染液，混匀后用血球计数板计算细胞的成活率。如果样本成活率高，无污染即可用于活率。如果样本成活率高，无污染即可用于传代。传代。(计数结果：计数结果：4.5106个个/ml)。将细胞分装至新鲜的培养液中，使细胞的最将细胞分装至
38、新鲜的培养液中，使细胞的最终数量调节至终数量调节至11053105个个/mL。置于置于37二氧化碳培养箱中继续培养。二氧化碳培养箱中继续培养。具体操作：具体操作：每两个小组共用一个培养瓶配制每两个小组共用一个培养瓶配制100ml100ml的的生长培生长培养基养基每人取每人取10ml10ml培养基到自己的细胞培养瓶内培养基到自己的细胞培养瓶内向细胞培养瓶内接种向细胞培养瓶内接种400ul400ul的的HeLaHeLa细胞株原液细胞株原液放入二氧化碳培养箱，放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖旋松瓶盖根据细胞的数量看细胞瓶是否平放或直立放置根据细胞的数量看细胞瓶是否平放或直立放置观察观察倒置显微镜的使用方
39、法倒置显微镜的使用方法利用课余时间和下次实验课时间用倒置显微镜进行利用课余时间和下次实验课时间用倒置显微镜进行观察。观察。五、实验报告五、实验报告描绘在倒置显微镜下观察到的现象。描绘在倒置显微镜下观察到的现象。六、思考题六、思考题如何防止传代过程的可能污染？如何防止传代过程的可能污染？一、实验目的一、实验目的掌握死活细胞的鉴别原理及方法。掌握死活细胞的鉴别原理及方法。四、四、死活细胞的鉴别死活细胞的鉴别实验五实验五 宫颈癌宫颈癌HeLaHeLa细胞株培养细胞株培养二、实验原理二、实验原理细胞的存活率是反映细胞群体生活状态细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的的重要
40、指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。死活，最常用到的方法是染色排除法。其原理是：许多酸性物质不容易穿过活其原理是：许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以此来区别死活细细胞内，使其着色，以此来区别死活细胞。胞。三、材料和试剂三、材料和试剂材料：材料：HeLa细胞株细胞株试剂：试剂：0.4%0.4%台盼蓝溶液（台盼蓝溶液（生理盐水配制生理盐水配制why？）四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤将细胞悬液充分混匀后取将细胞悬液充分混匀后取20ul20ul放入干净的离心管中，放入干净的离心管中，加入等体积
41、的加入等体积的0.4%0.4%的台盼蓝染液混合，放置的台盼蓝染液混合，放置2min2min。取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。注意滴液入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。注意滴液勿有气泡，也不能太多（约勿有气泡，也不能太多（约10ul10ul），否则会使盖片），否则会使盖片浮起而是细胞计数不准。浮起而是细胞计数不准。低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。找出计数板上的方
42、格，计算四角大格内总的细胞数，找出计数板上的方格，计算四角大格内总的细胞数，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。五、五、实验结果实验结果每毫升原液细胞数每毫升原液细胞数=5=5格中的细胞总数格中的细胞总数/5/5 2525（1616）10104 4 稀释倍数稀释倍数细胞存活率（细胞存活率（%）=（细胞总数（细胞总数-死细胞数）死细胞数）/细胞总数细胞总数六、实验报告六、实验报告讨论细胞存活率在研究中应用和意义。讨论细胞存活率在研究中应用和意义。实验五实验五 宫颈癌宫颈癌HeLaHeLa细胞株培养细胞株培养五、五、细胞调亡和坏死的识别细胞调亡和
43、坏死的识别(选做选做)一、实验目的一、实验目的了解细胞凋亡和坏死的形态特征了解细胞凋亡和坏死的形态特征二、实验原理二、实验原理细胞凋亡细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境损伤的一种现象，而是为更好地适应生
44、存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞发生凋亡时，而主动争取的一种死亡过程。细胞发生凋亡时，就像树叶或花的自然凋落一样就像树叶或花的自然凋落一样 。细胞坏死细胞坏死是因病理而产生的被动死亡，如物理是因病理而产生的被动死亡，如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。坏死细胞的膜通透性增高，致导致细胞坏死。坏死细胞的膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，早期核无明使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，早期核无明显形态学变化，最后细胞破裂。另外坏死的细显形态学变化，最后细胞破裂。另外坏死的细胞裂解要释放出内含物，并常引起炎症反应；胞裂解要释放出
45、内含物，并常引起炎症反应；在愈合过程中常伴随组织器官的纤维化，形成在愈合过程中常伴随组织器官的纤维化，形成瘢痕。瘢痕。凋亡凋亡坏死坏死三、材料和试剂三、材料和试剂材料：人类淋巴细胞株材料：人类淋巴细胞株试剂：试剂：0.075 mol/L 0.075 mol/L KClKCl 溶液、甲醇、冰醋酸溶液、甲醇、冰醋酸 、GiemsaGiemsa染液染液 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤1 1、细胞收集：取、细胞收集：取1ml1ml细胞悬液于小离心管中，细胞悬液于小离心管中，1000rpm1000rpm离心离心5min5min，弃上清。，弃上清。2.2.低渗：向沉淀中加入温浴的低渗：向沉淀中加入温
46、浴的0.075 mol/L 0.075 mol/L KClKCl 溶液溶液1ml1ml，打成细胞悬液，准确低渗，打成细胞悬液，准确低渗10 min10 min。3.3.预固定：用新鲜固定液（甲醇预固定：用新鲜固定液（甲醇冰醋酸冰醋酸=31=31）预）预固定一次，室温放置固定一次，室温放置10 min10 min，1000 rpm1000 rpm离心离心5 min5 min收收集沉淀。集沉淀。4.4.固定：向沉淀中加入新鲜固定液固定：向沉淀中加入新鲜固定液1ml1ml，室温放置，室温放置10 10 minmin，1000 rpm1000 rpm离心离心5 min5 min，弃上清。，弃上清。5.
47、5.制片：按照沉淀物的量加入几滴固定液，轻轻打制片：按照沉淀物的量加入几滴固定液，轻轻打匀后滴片并标记好，室温下空气干燥。匀后滴片并标记好，室温下空气干燥。6 6染色：将干燥的片子在染色：将干燥的片子在GiemsaGiemsa染液（母液与染液（母液与3DW3DW体积比为体积比为1 1：6 6）中染色）中染色5min5min，空气干燥后镜检。，空气干燥后镜检。五、五、实验结果实验结果在显微镜下分别找出凋亡和坏死的细胞，描述在显微镜下分别找出凋亡和坏死的细胞，描述形态特征。形态特征。实验六实验六 细胞器的分离与观察细胞器的分离与观察一、细胞核的分离与观察一、细胞核的分离与观察二、线粒体的分离与观察
48、二、线粒体的分离与观察一、实验目的一、实验目的了解细胞器的分离原理了解细胞器的分离原理掌握差速离心和密度梯度离心技术掌握差速离心和密度梯度离心技术二、实验原理二、实验原理细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就要将器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种物理方这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织制成匀浆，法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释放出来。细胞中的个中亚组分即从细胞中释放出来。细胞内不同结构
49、的细胞器大小密度存在差异，因细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原理，常用不同转速的离心法来分离不同据这一原理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分级分离的方法有的细胞器。分级分离的方法有差速离心和密度梯差速离心和密度梯度离心度离心两种。两种。分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织其过程包括组织细胞匀浆细胞匀浆、分级分离分级分离和和分析分析三步，这种方法已成为
50、研究亚细胞成分的化三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。学组成、理化特性及其功能的主要手段。(1)(1)细胞匀浆细胞匀浆(Homogenization)(Homogenization)：低温条件下，：低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即即0.25mol0.25molL L蔗糖蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。细胞器及其包含物的匀浆。(2)(2)分级分离分级分离(Fractionation)(Fractionation)：由低速到高速离：由低速到高速离心逐渐沉降。先