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1、紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法原理、应用及有关注意事项原理、应用及有关注意事项第一节第一节 概述概述 紫外可见分光光度（UVVIS)法是一种常用的检验方法，它是通过被测物质在紫外光区的特定波长或一定波长范围内的吸光度，对该物质进行定性和定量分析的方法。w紫外光谱是物质在200400 nm的近紫外光区和400850 nm的可见光区的吸收光谱。通常使用的紫外可见分光光度计的工作波长范围为190900nm,本法在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。适用于微量和痕量组分的分析，测定灵敏度可达到10-410-7g/ml或更低范围。第二节第二节 原理原理 w紫外分光光度法之所以能成为一种分
2、析方法，主要依据两点：w一、就是我们常说的吸收度，2005年版药典已将它改为吸光度，这样说可能更准确些。就是物质对光的吸收程度。我们首先说一下电磁波，所有电磁波在性质上都完全相同的，他们之间的区别仅在于波长或频率的不同。w按照波长排列从短到长依次为r射线、x射线、紫外线、可见光、红外线、微波、无线电波等。电磁辐射源与物质作用时，会与物质间产生能量交换。按物质和辐射能的转换方向，光谱法可分为吸收光谱法和发射光谱法两大类。电磁辐射源照射试样时，其原子或分子选择吸收某些具有适宜能量的光子，使相应波长位置出现吸收线或吸收带，所构成的光谱为吸收光谱。w利用物质的吸收光谱进行定量、定性及结构分析的方法称为
3、吸收光谱分析法。紫外可见吸收光谱是一种分子吸收光谱，它是由于分子中原子的外层电子跃迁而产生的。w因此，紫外吸收主要决定于分子的电子结构，故紫外光谱有称为电子光谱。在不同的波长下测定物质对光吸收的程度（吸光度），以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标，所绘制的曲线称为吸收光谱，测定的波长范围在紫外可见区，称紫外可见光谱，简称紫外光谱。w由上图可以看出吸收光谱的特征：曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以max表示。曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，所对应的波长，称最小吸收波长，以min 表示。曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，形状像肩的部位，称肩峰，以sh表示。w在吸收曲线的
4、波长最短的一端，曲线上“D”处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。w二、Beer-lambere定律，它是描述物质对单色光吸收强弱与吸光物质的厚度和浓度间关系的定律。w数学表达式为A=ELC A为吸光度，吸光度与浓度或厚度之间是正比关系，其中E是比例常数，称为吸光系数。w正是由于Beer-lambere定律的发现，吸光度才与物质的浓度联系起来，紫外分光光度法才应用于物质的测定。w第三节应用第三节应用w上面简单讲了紫外分光光度法的工作原理，下面系统讲一下紫外分光光度法的应用，主要讲一下它在药品检验中各种用途。w某些物质的吸收光谱上可出现几个吸收峰，不同的物质有不同的吸收峰。同一物质的吸收
5、光谱有相同的max，min，sh；而且同一物质相同溶度的吸收曲线应相互重合。这句话揭示了紫外分光光度法的应用依据。w应用主要分四个方面：w第一：药品的定性鉴别w定性鉴别具体又分三个方法w比较光谱一致性w吸收光谱中，max、min、肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照。（对照时须注意测定的条件，如溶剂、浓度等。溶剂可能会影响整个光谱的形状，比如多潘立酮片紫外鉴别时用开封的异丙醇所分析的光谱形状就与天津的试剂不一致。）w采用紫外光谱进行定性鉴别有一定的局限性，由于化合物紫外吸收峰较少
6、，而且峰形都很宽，不象红外光谱是许多指纹峰，在成千上万种有机化合物中，不同的化合物可有相似的吸收光谱，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基团，为进一步确证，可换一种溶剂或采用不同酸碱性的溶剂，再分别把对照品和样品配成溶液测定光谱作比较。如果两种纯化合物的紫外光谱明显差别时，则可以肯定两种化合物不是同一物质。w对比吸收光谱特征数据的一致性w最常用于鉴别的光谱特征数据有吸收峰（max）和峰值吸光系数（max或E1%1cm），这是因为峰值吸光系数大，测定灵敏度较高，且吸收峰处与相邻的波
7、长处吸光系数值的变化较小，测量吸光度时受波长变动影响较小，可减少误差。不只1个吸收峰的化合物，可同时用几个峰值做鉴别依据。（如药检所去年以来检的创可贴，就是在257nm、262nm、269nm三个波长处测定最大吸收，规定三个波长处都应有最大吸收，没有最大吸收就可以判定为假药）。w肩峰或吸收谷处的吸光度测定受波长变动影响也较小，有时也可用谷值、肩峰值与峰值同时作鉴别依据。（比如甲硝唑片的第三个鉴别就是分别在277 nm和241 nm的波长处分别测最大吸收和最小吸收。）w具有不同吸光基团的化合物可有相同的最大吸收波长，但它们的摩尔吸光系数常有明显的差别，所以摩尔吸光系数常用于分子结构分析中吸光基团
8、的鉴别。对于分子中含有相同吸光基团的物质，他们的摩尔吸光系数常很接近，但可因相对分子质量不同，使百分吸光系数的值差别较大，可以用百分吸光系数作为鉴别的依据。（比如结构相似的甲基睾丸酮和丙酸睾丸素在无水乙醇中的最大吸收波长max都在240nm，但在该波长处的E1%1cm数值，前者为540，而后者为460，因而有较大的鉴别意义）。w（摩尔吸光系数的意义是在一定的波长下，溶液浓度为1mol/L厚度为1cm时的吸光度。百分吸光系数，又称比吸光系数，只在一定波长下，溶液浓度为1（W/V）厚度为1cm时的吸光度。）w对比吸光度比值的一致性w有时物质的吸收峰较多，可规定在几个吸收峰处吸光度或吸光系数的比值作
9、为鉴别标准。（比如维生素B12注射液的鉴别，规定应在361nm与550nm的波长处有最大吸收；361nm波长处的吸光度与550nm波长处的吸光度的比值应为3.153.45）。w如果被测物质的吸收峰和对照品的相同，且峰处吸光度或吸光系数的比值又在规定范围之内，则可考虑被测样品与对照品分子结构基本相同。w第二：药品的纯度检测w纯度检测又分为杂质检查和杂质限量检测。w杂质检查w若该物质本身在紫外光区无吸收，而其杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或杂质的吸收峰处该物质无吸收，则可用本法作杂质检查。（例如，乙醇中可能含有苯的杂质，苯的max为256nm，而乙醇在此波长处几乎无吸收，乙醇中含苯量低达0.00
10、1，也能从光谱中检查出来，这个应用前景很广阔。）w若化合物在某波长处有强的吸收峰，而所含杂质在该波长处无吸收或吸收很弱，则化合物的吸光系数将降低，若杂质在该波长有比此化合物更强的吸收，将会使化合物的吸光系数增大，且会使化合物的吸收光谱变形。（举一个间接的例子吧，前一段时间快检车抽到一批吗叮啉，红外快检认定是假药，送到所里以后，我们用薄层法做了一下，发现样品也显斑点，位置基本一致，而且斑点很大，按说可以认定样品不假，慎重其间，我们就有作了一个紫外鉴别，发现它在288nm处没有最大吸收，而在240nm处有很强的吸收，紫外图谱和标准品差异明显，最后认定为假药）。w杂质限量检测w限度w药品纯与否是相对
11、的，要想制得一个纯品，所花费得成本很高，对于我们常用的药品来说，纯品意义不大，所以药典就规定了一个允许杂质存在的限度，就是杂质限量。紫外常用来检测杂质限量。例如肾上腺素在合成过程中有一个中间体肾上腺酮，当它还原成肾上腺素时，反应不够完全而带入产品中，成为肾上腺素的杂质，影响肾上腺素的疗效。因此，肾上腺酮的量必须规定在杂质限量之下。在310nm处，肾上腺酮有最大吸收，而肾上腺素则几乎没有吸收，因此，测定肾上腺素盐酸溶液在310nm波长处的吸光度，可检测肾上腺酮的混入量。（具体方法为将肾上腺素用（9-2000）的盐酸制成2.0mg/ml的溶液，在310nm的波长处测定，吸光度不得过0.05）。在比
12、如，我们常用的VC片，由于氧化变为黄色，影响到疗效，将它配制成0.05g/ml的水溶液，在440nm的波长处测定吸光度，不得过0.07。w比值w有时也会用峰谷吸收度的比值控制杂质限量。例如，碘磷定有很多杂质，如顺式异构体、中间体等，在碘磷定的最大吸收波长294nm处，这些杂质无吸收，但在262nm碘磷定的吸收谷处有吸收，则可利用碘磷定的峰谷吸光度的比值作为杂质限量检查指标，已知纯品碘磷定的A294/A2623.39，如果在262nmw处的吸光度增加，使峰谷吸光度之比小于3.39。因此，可以规定一个峰谷吸光度的最小允许值，作为限制杂质含量的限度。w三：比色法w测定能吸收可见光的有色溶液的方法称为
13、可见分光光度法，通常称为光电比色法或比色法。w第四：含量测定w根据Beer-lambere定律，物质在一定波长处的吸收度与浓度之间是线性关系。因此只要选择适宜的波长测定溶液的吸光度，就可以求出其浓度。通常应选择被测物质吸收光谱的吸收峰处，以提高灵敏度并减少测量误差，被测物质如有几个吸收峰，可选不易有其他物质干扰的较高吸收峰，一般不选光谱中末端吸收峰。w单组分物质的含量测定w就是物质有单一成份构成，常用的测定法有对照品对照法、吸光系数法、标准曲线法。标准曲线法不常用，个别药品项下有具体方法时用。下面具体讲以下前两种方法：w（1）对照品比较法 可根据供试品溶液及对照溶液的吸光度与对照品溶液的浓度以
14、正比法算出供试品溶液的浓度，再计算含量。w C样品A样品C对照/A对照w式中 A为吸光度值；C为测试液浓度（以mg/ml计）。w举例:双氯芬酸钠片 w平均片重0.1044g 称样0.2096g w对照品称重0.0504gw稀释过程:样品加乙醇100ml,溶解过滤,再量取续滤液2ml加乙醇稀释至100ml.w样品吸收度值 284nm 0.419w对照品吸收度值 284nm 0.441w w0.4190.0504100.00100.002.0010000.1044w含量=-100%=95.40%w 0.441250.2096100.00100.002.00w（2）吸收系数法 中国药典规定的吸收系数
15、。系指E1%1cm，即在指定波长时，光路长度为1cm，试样浓度换算为1（g/ml）时的吸光度值，故应先求出被测样品的E1%1cm值，再与规定的E1%1cm值比较，可计算出供试品的含量w AwE1%1cm（样品）-w CLwA为供试品溶液测得的吸光度值；wC为供试品溶液的百分浓度，即100ml中所含溶质的克数（g/ml）：wL为吸收池的光路长度（cm）。wE1%1cm样品w供试品的含量100w E1%1cm标准wE1%1cm样品 为根据前式计算出的供试品吸收系数：wE1%1cm标准 为药典或药品标准中规定的吸收系数。w举例:甲硝唑片 w平均片重0.2609g 称样0.0658g 最大吸收277n
16、mw稀释过程:样品加9-1000盐酸100ml,溶解过滤,再量取续滤液5ml加9-1000盐酸稀释至200ml.w百分吸收系数 377w吸收度值 277nm 0.461w 0.4610.2609100.00200.00w含量=-100%=96.97%w 3770.06585.000.2100w二、多组分定量测定w解线性方程组法w等吸收双波长消去法w系数倍率法w导数光谱法w第四节第四节 注意事项注意事项w（一）使用的吸收池必须洁净，并注意配对使用。量瓶、移液管均应校正、洗净后使用。w（二）吸收池有光学玻璃杯和石英玻璃杯两种。光学玻璃杯因为普通光学玻璃吸收紫外光，因此只能用于可见光，适用波长范围是
17、400nm2000nm。石英玻璃杯可透过紫外光、可见光和红外光，是最常使用的吸收池，使用波长范围是180nm3000nm。吸收池的形状有长方形，方形和园筒形，光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容积3ml），光程要求极精确，透光的玻璃面要严格垂直于光路，有的石英杯上方刻有箭头“”，标明杯子使用时的透光方向，反方向使用会有偏差。石英杯通常还配有玻璃或塑料盖，用以防止样品挥发和氧化，以及杯内样品的快速混合。w吸收池使用注意事项：w吸收池作为紫外分光光度计的主要部件，使用时应注意以下几点：取吸收池时，手指应拿毛玻璃面的两侧，严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。装盛样品以池体的4/5为
18、度，使用挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无溶剂残留。严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。为防止溶剂挥发后溶质残留在池子的透光面，可先用蘸有空白溶剂的擦镜纸由上而下擦拭干净。吸收池放入样品室时应注意方向相同。w吸收池的校正：当吸收池中装入同一溶剂，在规定波长测定各吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者，可以配对使用，否则必须加以校正。要固定参比杯和样品杯，可在杯的毛玻璃面上写上记号。用盛有参比液的参比杯和样品杯测定吸光度“A0”，样品杯换上样品液后测定的吸光度为“A1”，则校正后的实际吸光度A为：A=A1A0w高档的分光光度计有自动置零系统，可将二个
19、杯子的偏差置零。w 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。w要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在 1洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净，要求杯壁不挂水珠，还可以用绸布丝线或软塑料制作一个小刷子清洗杯子。吸收池如污染不易洗净时可用硫酸发烟硝酸（3：1V/V）混合液稍加浸泡后洗净备用。如用铬酸钾清洁液清洗时，吸收池不宜在清洁液中长时间浸泡，否则清洁液中铬酸钾结晶会破坏吸收池的光学表面，并应充分用水冲洗，以防铬酸钾吸附于吸收池表面。w（三）测定前应先检查所用的溶剂在测定供试品所用的波长附近是否符合要
20、求，可用1cm石英吸收池盛溶剂以空气为空白（即参比光路中不放置任何物质）测定其吸收度，应符合下表规定。w波长范围（nm）220240 241250 251300 300以上w吸光度 0.4 0.2 0.1 0.05w所用溶剂应不超过其截止使用波长。w每次测定时应采用同一厂牌批号，混合均匀的 1批溶剂。比如我们前面说到的检验多潘立酮用的异丙醇。还有一次我们检验谷维素的含量，做了几批含量都偏高，超出了上限（105.0），反复作，找不到原因，最后考虑到是试剂正庚烷的问题，换了一个厂家的就可以了。w（四）供试品溶液浓度除各该品种已有注明外，其吸收度以在0.30.7之间为宜，吸光度读数在此范围误差较小。
21、w（五）测定时除另有规定外，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，测定吸光度实际上是透光率，而在测定光强弱时，不只是由于被测物质的吸收所致，还有溶剂和容器的吸收，光的色散和界面反射等因素，都可使透射光减弱，用空白对照可排除这些因素的干扰。空白是指与试样完全相同的溶剂和容器，只是不含待测物质。w（六）供试品应取2份，如为对照品比较法，对照品一般也应取2份。平行操作，每份结果对平均值的偏差应在0.5%以内。w（七）选用仪器的狭缝宽度应小于供试品吸收带半高度的10，否则测得的吸收度值会偏低，狭缝宽度的选择应以减少狭缝宽度时供试品的吸收度不再增加为准，对于大部分被测品种，可以使用2nm缝宽。但当吸收
22、带的半高宽小于20nm时，则应使用较窄的狭缝，例如青霉素钾及钠的吸光度检查需要用1nm缝宽或更窄，否则其264nm的吸光度会偏低。w(八)用于制剂含量测定时，应注意供试液与对照液的pH值是否一致，如pH值对吸收有影响，则应调溶液的pH值一致后再测定吸光度。w最后，结合几年来的检验经历，谈一下常见的问题波长偏移，就是超出了药典规定的2nm，原因可能是仪器预热时间不够，记得有一次做甲硝唑，规定在277nm有最大吸收，可测得最大吸收在280nm，找不到原因，重新清零，还是不行。最后把仪器重启后，可以了，这可能就是仪器故障。操作过程有问题，比如避光，超声等。我们做硝苯地平片，要求避光，如果避光程度不够
23、，波长也会偏移出2nm。w在如上次我们做农村评价性抽验，多潘立酮片，药典规定水浴溶解，由于批次多，为了加快溶解速度，我们水浴后又对它超声处理，结果造成样品图谱于对照品不太一致。w我的课讲完了，谢谢大家！w 鉴别 w 取含量项下的溶液，照紫外-可见分光光度法测定，在361nm与550nm的波长处有最大吸收；361nm波长处的吸光度与550nm波长处的吸光度的比值应为3.153.45。w仪器：编号：w狭缝：nm 配对：w 波长（nm）：359 360 361 362 363 w 吸收度A值：w 波长（nm）:548 549 550 551 552w 吸收度A值：w A361nm/A550nm=w
24、结果在 nm与 nm有最大吸收，361nm波长处的吸光度与550nm波长处的吸光度的比值为 。w（规定应在361nm与550nm的波长处有最大吸收；361nm波长处的吸光度与550nm波长处的吸光度的比值应为3.153.45）w 规定w w含量测定 避光操作，精密量取本品适量加水定量稀释成每1ml中约含维生w素B1225ug的溶液，照紫外-可见分光光度法，在361nm的波长处测定吸光度，w按C63H88CON14O14P的吸收系数为207计算，即得。w计算，即得。w仪器：编号：w狭缝：配对：w波长（nm）：359 360 361 362 363wA（1）：w（2）：w计算：w（1）w（2）w平均值：w （规定应为标示量的90.0%110.0%）w 规定