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1、酶的组织化学 酶组织化学反应主要经过两步：酶组织化学反应主要经过两步：1.1.酶酶促促反反应应，即即酶酶催催化化细细胞胞内内相相应应底底物物，生成无色的初级反应底物。生成无色的初级反应底物。2.2.显显色色反反应应，捕捕获获和和偶偶联联。将将初初级级反反应应产产物物与与捕捕获获剂剂反反应应，经经过过一一步步或或两两步步反反应应生生成成有有色色的的最最终终反反应应产产物物，或或将将初初级级反反应应产产物物与与一一些些偶偶联联剂剂发发生生偶偶联联反反应应生生成成有色沉淀，显示酶活性部位。有色沉淀，显示酶活性部位。遵循原则：遵循原则：1.1.尽量保持组织细胞生活时的形态和结构。尽量保持组织细胞生活时
2、的形态和结构。2.2.尽尽量量保保持持组组织织细细胞胞生生活活时时酶酶及及其其他他成成分分的的活性，不影响酶的活性和分布。活性，不影响酶的活性和分布。3.3.底底物物和和辅辅助助剂剂必必须须迅迅速速而而同同步步地地渗渗透透到到组组织和细胞中去。织和细胞中去。4.4.底物最好只能被一种酶催化分解。底物最好只能被一种酶催化分解。5.5.尽量减少初级反应产物在组织细胞内尽量减少初级反应产物在组织细胞内的弥散程度。的弥散程度。6.6.反应产生的最终反应产物应是不溶于反应产生的最终反应产物应是不溶于水的有色而稳定的物质，沉积于原位，其水的有色而稳定的物质，沉积于原位，其颜色深度与物质含量或酶活性应有一定
3、量颜色深度与物质含量或酶活性应有一定量效关系。效关系。7.7.由于酶的活性可受到很多因素影响，由于酶的活性可受到很多因素影响，因而在酶生化方面有许多要求，以保证因而在酶生化方面有许多要求，以保证充分显示酶的活性：充分显示酶的活性：最适孵育温度（最适孵育温度（25-3725-37。C C）最适最适pHpH值值 最适底物及辅助物浓度最适底物及辅助物浓度 激活剂与抑制剂激活剂与抑制剂 酶的组织化学方法基本原理酶的组织化学方法基本原理沉淀反应法沉淀反应法 1.1.金属盐法金属盐法（金属阳离子沉淀反应）由（金属阳离子沉淀反应）由于酶的活性可使孵育底物分解，其生成于酶的活性可使孵育底物分解，其生成的基团可
4、与金属离子结合而产生沉淀，的基团可与金属离子结合而产生沉淀，最后在酶的活性部位生成不溶性的有色最后在酶的活性部位生成不溶性的有色金属盐沉淀。如金属盐沉淀。如钙钙-钴法显示碱性磷酸酶。钴法显示碱性磷酸酶。2.2.偶联偶氮色素法偶联偶氮色素法 由于酶活性可使由于酶活性可使含萘酚的底物化合物分解，其分解产物含萘酚的底物化合物分解，其分解产物可与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，可与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性的偶氮色素，以证明酶的活形成不溶性的偶氮色素，以证明酶的活性部位。性部位。电子传递法电子传递法 根据氧化还原的原理显示氧化酶和根据氧化还原的原理显示氧化酶和脱氢酶。脱氢酶的作用使底物脱氢
5、氧化，脱氢酶。脱氢酶的作用使底物脱氢氧化，脱下的氢可与作为受氢体的无色四唑盐脱下的氢可与作为受氢体的无色四唑盐或双四唑盐结合，后者被还原成甲或双或双四唑盐结合，后者被还原成甲或双甲潜紫蓝色沉淀。如甲潜紫蓝色沉淀。如琥珀酸脱氢酶显示琥珀酸脱氢酶显示方法属于此法。方法属于此法。水解酶类水解酶类 水解酶催化下列反应水解酶催化下列反应 ：AB+H AB+H2 2O AH+BOHO AH+BOH 包括酯酶、糖苷酶、肽酶、磷酸酶等。包括酯酶、糖苷酶、肽酶、磷酸酶等。碱性磷酸酶钙碱性磷酸酶钙-钴显示法钴显示法 原理：原理：AKPAKP在有激活剂（在有激活剂（MgMg+）存在和）存在和pH9.4pH9.4时，
6、将磷酸盐底物分解产生磷酸根时，将磷酸盐底物分解产生磷酸根离子，磷酸根离子被孵育液中高浓度的离子，磷酸根离子被孵育液中高浓度的钙盐所捕获，在有酶活性存在处生成磷钙盐所捕获，在有酶活性存在处生成磷酸钙沉淀，再加入硝酸钴，用酸钙沉淀，再加入硝酸钴，用CoCo2+2+置换置换 Ca Ca2+2+，从而生成磷酸钴沉淀，因其无色，从而生成磷酸钴沉淀，因其无色需通过硫化铵处理形成黑色硫化钴颗粒需通过硫化铵处理形成黑色硫化钴颗粒沉淀，显示酶活性所在部位，此沉淀与沉淀，显示酶活性所在部位，此沉淀与AKPAKP含量成正比。含量成正比。试剂配制：试剂配制：1.1.作作用用液液 2%2%巴巴比比妥妥钠钠 5ml5ml
7、；3%-3%-甘甘油油磷磷酸酸钠钠 5 5 mlml；2%2%无无水水氯氯化化钙钙 10ml10ml；0.1%0.1%硫硫酸酸镁镁 0.5 0.5 mlml；蒸蒸馏馏水水 2.5 2.5 mlml。此此液液pHpH为为9.49.4，如如不不到到9.49.4，可可用用0.1N 0.1N NaOHNaOH调节。调节。2.2%2.2%硝酸钴硝酸钴 3.1-2%3.1-2%硫化铵硫化铵（现配）（现配）操作步骤操作步骤 1.1.新新鲜鲜组组织织恒恒冷冷切切片片，切切片片直直接接入入孵孵育育液液3737。C 10-40 C 10-40 分钟。分钟。2.2.流水洗流水洗2 2分钟。分钟。3.2%3.2%硝酸
8、钴硝酸钴5 5分钟。分钟。4.4.蒸馏水洗。蒸馏水洗。5.5.硫化铵硫化铵3030秒秒-1-1分钟。分钟。6.6.蒸馏水洗。蒸馏水洗。7.7.甘油明胶封固。甘油明胶封固。碱性磷酸酶结果：结果：AKP AKP所在部位呈所在部位呈黑色硫化钴沉黑色硫化钴沉淀。淀。6-磷酸磷酸葡萄糖酶葡萄糖酶结果结果：酶活性处酶活性处为棕黄色为棕黄色硫化铅沉硫化铅沉淀，细胞淀，细胞核为阴性核为阴性反应。反应。对照对照 去底物对照，作用液中以蒸馏水代去底物对照，作用液中以蒸馏水代替替-甘油磷酸钠，其他步骤同上，酶反甘油磷酸钠，其他步骤同上，酶反应阴性。应阴性。氧化还原酶氧化还原酶催化氧化还原反应的酶。催化氧化还原反应的
9、酶。琥珀酸脱氢酶（琥珀酸脱氢酶（SDHSDH）硝基四唑盐法）硝基四唑盐法 原原理理：琥琥珀珀酸酸脱脱氢氢酶酶（SDHSDH）作作用用于于底底物物琥琥珀珀酸酸钠钠，脱脱下下氢氢，以以无无色色的的硝硝基基四四唑唑盐盐为为受受氢氢体体，后后者者获获氢氢后后被被还还原原为为不不溶溶于于水的有色甲潜，原位沉积于酶活性部位水的有色甲潜，原位沉积于酶活性部位。试剂配制试剂配制 0.2M 0.2M磷酸缓冲液磷酸缓冲液pH7.6 5mlpH7.6 5ml1 1A A液液 0.2M 0.2M琥珀酸钠琥珀酸钠 5ml 5ml B B液液 0.1%0.1%（1mg/ml1mg/ml）硝硝 基基 四四 唑唑 盐盐（Ni
10、tro-BTNitro-BT）10ml 10ml 临用前将两液等量混合，调整临用前将两液等量混合，调整pHpH至至7.67.6。操作步骤：操作步骤：1.1.新新鲜鲜组组织织恒恒冷冷切切片片，切切片片直直接接入入孵孵育育液液3737。C 5-40C 5-40分钟。分钟。2.2.蒸馏水洗。蒸馏水洗。3.3.甘油明胶封固。甘油明胶封固。琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶 结果：结果：酶活性部位为紫蓝色颗粒沉淀。酶活性部位为紫蓝色颗粒沉淀。对照对照 另配一孵育液，以等量的蒸馏水代另配一孵育液，以等量的蒸馏水代替替0.2M0.2M琥珀酸钠液，酶活性部位呈阴性。琥珀酸钠液，酶活性部位呈阴性。注意事项：注意事项：1.1.取取材材要要迅迅速速，立立即即低低温温冷冷冻冻，否否则则容容易引起酶的扩散。易引起酶的扩散。2.2.为为节节省省染染液液，可可采采用用滴滴染染，使使孵孵育育液液盖过切片，置于湿盒内孵育。盖过切片，置于湿盒内孵育。3.3.若若孵孵育育液液中中加加二二甲甲亚亚砜砜1ml1ml，可可使使线线粒粒体体的的膜膜通通透透性性增增加加，作作用用快快，酶酶定定位位清清晰。晰。