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1、Enzyme Enzyme HistochemistryHistochemistry1 概概 述述1、酶、酶（enzyme)：由活细胞产生，能在体内起催化由活细胞产生，能在体内起催化作用的一类作用的一类特异性蛋白质特异性蛋白质生物催化剂。生物催化剂。物质物质EABDC酶酶 促促 反反 应应E底物底物substrate2 概概 述述2 2、酶的命名：习惯命名法、酶的命名：习惯命名法命名原则命名原则举例举例1 1、酶对底物的特异性、酶对底物的特异性脂肪酶，核酸酶脂肪酶，核酸酶2 2、根据催化反应性质、根据催化反应性质（具有特异性）（具有特异性）催化底物水解反应，称水催化底物水解反应，称水解酶解酶3
2、 3、根据底物与催化反、根据底物与催化反应性质应性质催化乙醇脱氢的酶，称乙催化乙醇脱氢的酶，称乙醇脱氢酶。醇脱氢酶。4 4、根据酶的来源、根据酶的来源胃蛋白酶，胰蛋白酶等胃蛋白酶，胰蛋白酶等5 5、根据酶的特性、根据酶的特性碱性磷酸酶，酸性磷酸酶碱性磷酸酶，酸性磷酸酶3 概概 述述3 3、酶的分类：按酶促反应的性质，国际生物化学、酶的分类：按酶促反应的性质，国际生物化学 酶学会（酶学会（ECEC）将酶分为六类，如下表：将酶分为六类，如下表：EC编号编号 酶名酶名 1 氧化还原酶（氧化还原酶（oxidoreductases)2 转移酶（转移酶（transferases)3 水解酶（水解酶（hyd
3、rolases)4 裂解酶（裂解酶（lyases)5 异构酶（异构酶（isomerases)6 连接酶或合成酶连接酶或合成酶 （ligases or synthetases)4一、组织化学显示酶的方法一、组织化学显示酶的方法（一）免疫组织化学一）免疫组织化学（immunohistochemistry)Ag+Ab Ag-Ab胰岛胰岛B细胞细胞5一、组织化学显示酶的方法一、组织化学显示酶的方法(二）酶组织化学二）酶组织化学（enzyme histochemistry)1、定义：、定义：酶组化是用酶组化是用组织化学组织化学的方法证明酶的的方法证明酶的存在的一门学科，其目的在于阐明存在的一门学科，其目
4、的在于阐明组织细胞内组织细胞内的化学的化学反应、功能及其生物学意义。反应、功能及其生物学意义。维持维持C形形态和执行态和执行功能的功能的化化学物质学物质有色形象有色形象探讨其在生理或病理状态下形态与机能相结合的一门学科探讨其在生理或病理状态下形态与机能相结合的一门学科62、研究化学物质的方法：、研究化学物质的方法：7二、酶组织化学的基本理论二、酶组织化学的基本理论（一）酶的定位一）酶的定位 localization of enzyme 在一定组织细胞及细胞器的超微结构中存在着特在一定组织细胞及细胞器的超微结构中存在着特定的酶，其存在的特定部位称为酶的定位。定的酶，其存在的特定部位称为酶的定位。
5、细胞内酶的定位因酶的种类及细胞器不同而有差异，它们细胞内酶的定位因酶的种类及细胞器不同而有差异，它们都有自己固定的位置。因此所采用的定位检查法必须准确。都有自己固定的位置。因此所采用的定位检查法必须准确。酶酶 亚细胞部分亚细胞部分DNA核苷酸转移酶核苷酸转移酶 核核 SDH、CCO 线粒体线粒体 G-6-P 内质网内质网 ACP 溶酶体溶酶体 5-核苷酸核苷酸 质膜质膜 LDH 胞液胞液8线粒体线粒体结构结构酶类酶类间质间质三羧酸循环中的酶等三羧酸循环中的酶等内膜内膜SDH，CCO等等内外内外膜间膜间空隙空隙腺苷酸激酶、核苷酸腺苷酸激酶、核苷酸磷酸激酶等磷酸激酶等外膜外膜NADH脱氢酶、细胞脱
6、氢酶、细胞色素色素b5还原酶等还原酶等9二、酶组织化学的基本理论二、酶组织化学的基本理论（二）酶反应二）酶反应 是在一定条件下，组织细胞内的酶作用于底物，是在一定条件下，组织细胞内的酶作用于底物，将底物的分解产物作为反应产物，在作用部位进行捕将底物的分解产物作为反应产物，在作用部位进行捕捉，使其具有可见性。这种酶促反应称为捉，使其具有可见性。这种酶促反应称为组织化学酶组织化学酶反应反应（enzyme reaction of histochemistry)ESIRPE捕捉反应捕捉反应FRP10ESIRPE捕捉反应捕捉反应FRP S：底物，酶具有只作用于该底物的性质称底物，酶具有只作用于该底物的性
7、质称底物特异性底物特异性IRP（initial reaction product)：初级反应产物，指底物被初级反应产物，指底物被酶直接分解的物质，不溶于水、脂类最为理想，以免发生酶直接分解的物质，不溶于水、脂类最为理想，以免发生扩散。扩散。FRP(final reaction product)：最终反应产物，指不溶性最终反应产物，指不溶性IRP被偶联而显色。被偶联而显色。11三、光镜酶组织化学证明法三、光镜酶组织化学证明法（一）金属一）金属-金属盐法金属盐法（metal precipitation method)1 1、定义：、定义：指金、银、铜、铁、铝、钴等金属，指金、银、铜、铁、铝、钴等金
8、属，其盐和化合物或其本身都具有颜色，容易发生其盐和化合物或其本身都具有颜色，容易发生呈色反应。而且酶的反应产物和金属多半可以呈色反应。而且酶的反应产物和金属多半可以结合。因此，结合。因此，捕捉酶反应的分解产物，使其与捕捉酶反应的分解产物，使其与金属结合，利用其呈色反应，再现出酶反应的金属结合，利用其呈色反应，再现出酶反应的部位，以证明酶的存在。部位，以证明酶的存在。这类方法总称为这类方法总称为金属金属-金属盐法或金属沉着法。金属盐法或金属沉着法。大部分大部分水解酶水解酶用此方用此方法证明。法证明。Fe2+DP+DPFe2+122、方法：、方法：三种三种（1）第一种方法：）第一种方法：Gomor
9、i和高松（和高松（1939）SE+MP1P2+Fe置换置换显色显色沉着在作沉着在作用局部用局部证明酶反应证明酶反应酶反应酶反应13如：证明碱性磷酸酶方法如：证明碱性磷酸酶方法R-PO4Na2+H2O R-OH+CaHPO4 CoHPO4 金属置换金属置换ALPCa2+Co2+CoS(NH4)2S酶反应酶反应沉着沉着显色显色用钴置换用钴置换硫化钴法硫化钴法（CoS method)用银置换用银置换硝酸银法或银反应法硝酸银法或银反应法（silver method)14（2）第二种方法：）第二种方法：是酶作用于酶底物后生成的分解产物与底物孵育是酶作用于酶底物后生成的分解产物与底物孵育液中的金属离子相结
10、合，直接沉着于酶的反应部液中的金属离子相结合，直接沉着于酶的反应部位，然后使其显色。反应式如下：位，然后使其显色。反应式如下：R-PO4Na2+H2O R-OH+PbHPO4 PbSPb2+(NH4)2S酶反应酶反应沉着沉着显色显色使用此种方法的条件是底物溶液中使用此种方法的条件是底物溶液中H+浓度为浓度为中性或弱中性或弱酸性酸性，常常利用易获得的硝酸铅或醋酸铅。因此本法，常常利用易获得的硝酸铅或醋酸铅。因此本法常被用于常被用于ACP和在中性附近起作用的和在中性附近起作用的磷酸酯酶磷酸酯酶类。本类。本法称为法称为硫化铅法硫化铅法（PbS method)15（3 3）第三种方法：）第三种方法：与
11、使用天然底物的前两种方法不同，本法与使用天然底物的前两种方法不同，本法使用的是使用的是人工合成底物人工合成底物，在酶的作用下，在酶的作用下，底物的底物的分解产物与特定的金属结合分解产物与特定的金属结合，立即立即显色显色，或通过显色操作使其显色，然后进，或通过显色操作使其显色，然后进行观察。行观察。163、金属、金属-金属盐法的优缺点金属盐法的优缺点（1）优点：）优点：底物、捕捉剂价格便宜。底物、捕捉剂价格便宜。金属离子容易反应，金属离子容易反应，沉着颗粒微细，反应色调沉着颗粒微细，反应色调鲜明，反差比较明显。鲜明，反差比较明显。（2 2）缺点：）缺点：易退色。易退色。组织细胞中有些成分可吸附金
12、属离子，产生组织细胞中有些成分可吸附金属离子，产生假阳性反应。假阳性反应。铅法显示铅法显示ACP17三、光镜酶组织化学证明法三、光镜酶组织化学证明法（二）偶联偶氮色素法二）偶联偶氮色素法（coupling azo dye method)或称或称偶氮色素法偶氮色素法1 1、定义：、定义：是用人工合成的酶底物，在酶的作用下，是用人工合成的酶底物，在酶的作用下，产生产生分解产物分解产物，后者，后者与重氮盐结合与重氮盐结合，引起，引起偶联偶氮反偶联偶氮反应应，形成，形成不溶性的偶氮色素不溶性的偶氮色素，以此证明酶的定位。，以此证明酶的定位。SEP+N偶联偶氮反应偶联偶氮反应偶氮色素偶氮色素18偶氮色素
13、的颜色由重氮盐的种类所决定。偶氮色素的颜色由重氮盐的种类所决定。如：坚牢蓝如：坚牢蓝BB蓝色蓝色 坚牢红坚牢红TRTR红色红色 坚牢蓝坚牢蓝VBVB褐色褐色2 2、底物、底物萘酚系列化合物萘酚系列化合物2-2-萘酚、萘酚、1-1-萘酚、萘酚、6-6-溴溴-2-2-萘酚、萘酚萘酚、萘酚ASAS、萘酚萘酚ASAS衍生物等衍生物等 溶解性逐渐降低溶解性逐渐降低肾小管中的碱性磷酸酶肾小管中的碱性磷酸酶193 3、偶联偶氮色素法优、缺点、偶联偶氮色素法优、缺点（1 1）优点：）优点：正常组织细胞中无此底物。正常组织细胞中无此底物。作用时间短，不易发生酶的丢失。作用时间短，不易发生酶的丢失。不易褪色。不易
14、褪色。（2 2）缺点：）缺点：底物价格昂贵。底物价格昂贵。底物的分解产物有不同程度的扩散。底物的分解产物有不同程度的扩散。重氮盐有不同程度的抑制酶活性作用。故必须重氮盐有不同程度的抑制酶活性作用。故必须选用抑制作用最弱的种类使用。选用抑制作用最弱的种类使用。肝细胞中的肝细胞中的ACPACP204 4、方法：、方法：（1 1）同同时时偶偶联联法法：这这种种偶偶联联法法，是是在在底底物物混混合合液液中中，通通过过酶酶的的分分解解作作用用所所得得到到的的沉沉着着物物，立立即即形形成重氮化合物和偶氮色素。成重氮化合物和偶氮色素。（2 2）后偶联法：）后偶联法：该方法是为了防止重氮盐对酶该方法是为了防止
15、重氮盐对酶的抑制作用，的抑制作用，先使酶在底物内发生作用先使酶在底物内发生作用，使分解产，使分解产物沉着，物沉着，然后再然后再浸渍于浸渍于重氮盐重氮盐液中，使其形成偶氮液中，使其形成偶氮色素。色素。以上两种偶氮色素形成的原理完全相同。以上两种偶氮色素形成的原理完全相同。由于偶氮色素法的开展，某些用金属由于偶氮色素法的开展，某些用金属-金属盐法金属盐法不能证明的酶，现在能够证明了。此法已被广泛使不能证明的酶，现在能够证明了。此法已被广泛使用。用。21三、光镜酶组织化学证明法三、光镜酶组织化学证明法（三）色素形成法三）色素形成法（pigment formation method)这是一组这是一组显
16、示酶定位的证明法显示酶定位的证明法，它与偶氮色素，它与偶氮色素法不同，在酶的作用下，使无色的化学物质在局部法不同，在酶的作用下，使无色的化学物质在局部形成色素而沉着。这种方法统称形成色素而沉着。这种方法统称色素形成法色素形成法。方法方法所显示的酶所显示的酶1、四唑盐法、四唑盐法脱氢酶脱氢酶2、靛酚蓝法靛酚蓝法氧化酶氧化酶3、靛兰形成法（靛蓝法）靛兰形成法（靛蓝法）磷酸酶、酯酶磷酸酶、酯酶4、联苯胺色素法联苯胺色素法过氧化物酶过氧化物酶5、黑色素形成法黑色素形成法DOPA-氧化酶、酪氨酸酶氧化酶、酪氨酸酶6、白色色素法白色色素法过氧化氢酶过氧化氢酶221、四唑盐法、四唑盐法 tetrazoliu
17、m method（1 1）定义：）定义：在含有在含有四唑盐四唑盐或或双四唑盐双四唑盐的底物混合液的底物混合液中，在脱氢酶的作用下，从底物分离出来的中，在脱氢酶的作用下，从底物分离出来的氢原子氢原子与与无色四唑盐无色四唑盐或或双四唑盐双四唑盐结合形成结合形成红色红色或或蓝色蓝色的甲簪的甲簪（formazan）或二甲簪（或二甲簪（difomazan）色素色素。这种色。这种色素沉着于酶作用的所在部位因而得知酶的定位。该法素沉着于酶作用的所在部位因而得知酶的定位。该法主要证明各种主要证明各种脱氢酶脱氢酶 。23（2 2）四唑盐的种类）四唑盐的种类 三苯四唑氯化物（三苯四唑氯化物（TTCTTC）蓝四唑盐
18、（蓝四唑盐（BTBT）新四唑盐（新四唑盐（NTNT）硝基蓝四唑盐（硝基蓝四唑盐（Nitro-BT)Nitro-BT)四氯四唑蓝氯化物（四氯四唑蓝氯化物（TNBTTNBT）是脂溶性的，是脂溶性的，能共染组织能共染组织细胞中的脂细胞中的脂肪。肪。24肾小管中的肾小管中的SDHSDH心肌中的心肌中的LDHLDH252、靛酚蓝法、靛酚蓝法 indophenol blue method NadiNadi反反应应,是是用用于于检检测测氧氧化化酶酶的的方方法法。把把二二甲甲基基-对对-苯苯二二胺胺和和-萘萘酚酚加加入入底底物物混混合合液液中中，由由酶酶作作用用而而释释放放的的氧氧与与此二者结合，形成靛酚蓝，
19、而显示出酶的定位。此二者结合，形成靛酚蓝，而显示出酶的定位。有有人人使使用用的的新新的的NadiNadi法法，既既以以4-4-氨氨基基-N-N、N-N-二二甲甲基基萘萘胺胺（ANDAND）代代替替二二甲甲基基-对对-苯苯二二胺胺。本本法法也也适适用用于于证证明明细细胞胞色色素氧化酶和过氧化物酶。素氧化酶和过氧化物酶。26肾肾小小管管中中的的细细胞胞色色素素氧氧化化酶酶27本法主要是以本法主要是以酯型吲哚酚化合物酯型吲哚酚化合物为酶的底物，在酶为酶的底物，在酶的作用下，分解出的作用下，分解出吲哚酚吲哚酚；在氧存在的情况下形成；在氧存在的情况下形成蓝色靛蓝蓝色靛蓝，于酶所在部位显色。此法又称吲哚酚
20、法，于酶所在部位显色。此法又称吲哚酚法（indoxylindoxyl method method）。酯型吲哚酚化合物酯型吲哚酚化合物:磷酸吲哚酚磷酸吲哚酚 醋酸吲哚酚醋酸吲哚酚 丁酰吲哚酚丁酰吲哚酚 验证磷酸酶、酯酶等。验证磷酸酶、酯酶等。3、靛兰形成法（靛蓝法）、靛兰形成法（靛蓝法）indigo formation method:28肾肾间间质质细细胞胞中中的的酯酯酶酶29四、酶组织化学的基本条件四、酶组织化学的基本条件用组织化学方法在组织细胞内证明酶，重要的是要用组织化学方法在组织细胞内证明酶，重要的是要具备三个条件：具备三个条件：第一：保存细胞结构（第一：保存细胞结构（preservat
21、ion of structure)。第二：保存酶（第二：保存酶（preservation of enzyme)。第三：保存定位（第三：保存定位（preservation of localization)。30（一）生物化学方面的要求一）生物化学方面的要求 酶组织化学的基础是组织化学，而化学反应又是组织化学酶组织化学的基础是组织化学，而化学反应又是组织化学的基础。所以化学反应的各种条件和影响化学反应的各种因素的基础。所以化学反应的各种条件和影响化学反应的各种因素都要考虑到。都要考虑到。酶是一种催化剂，但其并不参与化学反应本身，只是起到酶是一种催化剂，但其并不参与化学反应本身，只是起到加强酶组织化
22、学反应，显示出酶活性的高低的作用。影响酶活加强酶组织化学反应，显示出酶活性的高低的作用。影响酶活性的因素有多种，性的因素有多种，如底物的浓度、反应产物的强弱、温度、如底物的浓度、反应产物的强弱、温度、pHpH值和试剂质量等值和试剂质量等。同一种酶，在不同条件下，所显示酶的活性。同一种酶，在不同条件下，所显示酶的活性可以相差悬殊。因此，可以相差悬殊。因此，在进行酶组织化学研究时，应极其重视在进行酶组织化学研究时，应极其重视化学反应的良好程度，严格控制实验条件，化学反应的良好程度，严格控制实验条件，这样才能对获得的这样才能对获得的结果作出科学的判断和分析。结果作出科学的判断和分析。31（二）形态学
23、方面的要求二）形态学方面的要求1 1、尽可能保持组织细胞生活时的、尽可能保持组织细胞生活时的形态和结构形态和结构。2 2、尽可能保持组织细胞生活时的、尽可能保持组织细胞生活时的化学成分和酶的活性化学成分和酶的活性。3 3、染色法是已知的化学反应，各种条件均可控制。、染色法是已知的化学反应，各种条件均可控制。4 4、反应产物是一种有色的沉着物，、反应产物是一种有色的沉着物，颗粒要细，并能颗粒要细，并能保留在原位保留在原位。其颜。其颜色深度与物质含量或酶活性具有一色深度与物质含量或酶活性具有一定量效关系。定量效关系。5 5、显示的可视物质必须具有、显示的可视物质必须具有稳定性稳定性，以利于反复观察
24、。以利于反复观察。6 6、反应产物要具有、反应产物要具有特异性特异性。肿瘤细胞肿瘤细胞SDHSDH：四唑盐法四唑盐法32（三）酶组织化学的局限性三）酶组织化学的局限性1 1、定位方面的局限性：、定位方面的局限性：酶组织化学要求是使某一物质在原位上显示出来。但由于酶组织化学要求是使某一物质在原位上显示出来。但由于吸吸附、弥散和溶解附、弥散和溶解等现象，其等现象，其定位的改变或假定位定位的改变或假定位是多见的，是多见的，给分析结果带来很大困难。在进行酶组化染色反应时，用恒给分析结果带来很大困难。在进行酶组化染色反应时，用恒冷箱切片法、控制孵育条件、温度、冷箱切片法、控制孵育条件、温度、pHpH值和
25、时间可防止反应值和时间可防止反应产物扩散。产物扩散。酶组化酶组化大致定位大致定位核仁、胞核仁、胞质、质、C器器等等电镜细电镜细胞化学胞化学微细定位微细定位C器的微器的微细结构细结构分子水平定位分子水平定位33影响酶定位的因素影响酶定位的因素必要条件必要条件要求要求底物底物1 1、必须容易被水解、必须容易被水解2 2、底物应尽可能纯、底物应尽可能纯反应产物反应产物1 1、既不溶于水也不溶于脂中、既不溶于水也不溶于脂中2 2、必须易染，既有较高的着色指数或、必须易染，既有较高的着色指数或转化为易着色产物。转化为易着色产物。偶联剂偶联剂对反应产物必须具有高度偶联率。对反应产物必须具有高度偶联率。34
26、2 2、定性方面的局限性：、定性方面的局限性：由于组化是利用已知的化学反应来显示细胞内化学成由于组化是利用已知的化学反应来显示细胞内化学成分的性质，所以它具有特异的定性的优越性。但同样分的性质，所以它具有特异的定性的优越性。但同样有局限性。有局限性。（1 1）非特异性的问题：）非特异性的问题：有些方法的原理是根据某些有些方法的原理是根据某些特殊基团或某些特性，不可避免地造成一些非特异性特殊基团或某些特性，不可避免地造成一些非特异性染色。染色。（2 2）定位的不精确：）定位的不精确：如如PASPAS法显示糖原。法显示糖原。（3 3）有些物质被掩盖，不能全部显示出来。）有些物质被掩盖，不能全部显示
27、出来。如隐式如隐式脂肪。脂肪。为了确切定位，组化染色反应中，必须有对照试验。为了确切定位，组化染色反应中，必须有对照试验。可以极大的提高定性的可靠性。可以极大的提高定性的可靠性。353 3、定量方面的局限性：、定量方面的局限性：（1 1）原因：）原因：定量不精确是定量不精确是酶组化的最大局限性酶组化的最大局限性，它不同于试管中的化学分析，而是在极复杂的细它不同于试管中的化学分析，而是在极复杂的细胞微环境内进行化学反应，所要研究的物质或酶胞微环境内进行化学反应，所要研究的物质或酶的活性，均受到细胞内其他物质和细胞外各种因的活性，均受到细胞内其他物质和细胞外各种因素的影响。有些因素的性质不明，难以
28、控制。素的影响。有些因素的性质不明，难以控制。组组化反应产物都呈现可视的有色沉着物，存在于细化反应产物都呈现可视的有色沉着物，存在于细胞内不均匀的复杂结构中，不可能像化学反应在胞内不均匀的复杂结构中，不可能像化学反应在试管中得到的均质的产物，也不可能进行精密的试管中得到的均质的产物，也不可能进行精密的光谱吸收分析。光谱吸收分析。36常用的组化定量方法使用常用的组化定量方法使用加号加号与与积分法积分法表示的。以中表示的。以中性粒细胞中性粒细胞中碱性磷酸酶碱性磷酸酶活性的评级说明。活性的评级说明。（2 2）定量方法：）定量方法：符号符号等级等级着色强度着色强度-阴性阴性+弱阳性弱阳性浅灰浅灰/棕色
29、沉着物，弥散、无致密颗粒棕色沉着物，弥散、无致密颗粒+较强阳性较强阳性均着色均着色/棕黑色致密片状物，占胞质棕黑色致密片状物，占胞质1/21/2+强阳性强阳性充满棕黑色颗粒，致密块状沉着物较少充满棕黑色颗粒，致密块状沉着物较少+极强阳性极强阳性深黑色，充满致密块状沉着物深黑色，充满致密块状沉着物,可遮掩可遮掩C C核核37ALPALP活性可以用活性可以用阳性率阳性率或或阳性强度阳性强度表示。但阳性率不表示。但阳性率不能鉴别两种不同状态。因此需用积分法表示阳性强度，能鉴别两种不同状态。因此需用积分法表示阳性强度，才能作出准确判断。见下表：才能作出准确判断。见下表：用阳性率表示时，无区别；用积分法
30、表示后，发现呈用阳性率表示时，无区别；用积分法表示后，发现呈显著区别。此法是估量法显著区别。此法是估量法半定量技术半定量技术。02038（3 3）发展趋势：）发展趋势：（4 4）定量细胞化学目前常用的仪器与技术：）定量细胞化学目前常用的仪器与技术：显微分光光度计、显微荧光光度计、流式细胞光显微分光光度计、显微荧光光度计、流式细胞光度计、电镜度计、电镜X X射线显微定量分析技术、激光扫描共射线显微定量分析技术、激光扫描共聚焦显微镜（聚焦显微镜（LSCMLSCM）以及图像分析技术等。以及图像分析技术等。39五、影响酶活性的基本条件五、影响酶活性的基本条件酶组织化学方法的四个步骤：酶组织化学方法的四
31、个步骤：第一第一：酶的：酶的固定固定(fixation)。第二：酶的第二：酶的特异性反应（特异性反应（specific reaction)。第三：在最适条件下，酶第三：在最适条件下，酶反应产物沉着反应产物沉着(pricipitation)。第四：使沉着产物具有第四：使沉着产物具有可见性可见性(visualization)。40组织、细胞标本的制备步骤组织、细胞标本的制备步骤41(一）固定和切片标本的制作一）固定和切片标本的制作1 1、固定剂的性质：、固定剂的性质：（1 1）既要保持组织细胞的微细结构又要保持酶的活）既要保持组织细胞的微细结构又要保持酶的活性。性。（2 2）既不能溶解酶也不能使酶
32、活性部位发生移位。）既不能溶解酶也不能使酶活性部位发生移位。（3 3）既不能抑制酶反应也不能）既不能抑制酶反应也不能和其它步骤使用的试剂发生反应，和其它步骤使用的试剂发生反应，引起人为的产物。引起人为的产物。因此要根据酶的不同性质因此要根据酶的不同性质选择固定液的种类。酶对任何固定选择固定液的种类。酶对任何固定液都是敏感的。液都是敏感的。422 2、固定对酶活性的影响：、固定对酶活性的影响：433 3、切片厚度对酶活性的影响、切片厚度对酶活性的影响切片厚度：切片厚度：60m时容易出现时容易出现人工假象人工假象，浸透浸透速度减慢速度减慢。切片的厚度在。切片的厚度在40m以下时，反应液在以下时，反
33、应液在切片内部渗透均匀，并较为彻底，切片也能得到充切片内部渗透均匀，并较为彻底，切片也能得到充分的漂洗。分的漂洗。（2）孵育液的扩散常数与浓度孵育液的扩散常数与浓度决定着从组织外向决定着从组织外向组织内的组织内的渗透速度渗透速度，如捕捉剂，如捕捉剂Pb2+在在50m厚的切厚的切片孵育时，需时片孵育时，需时1分钟才能达到内部，因此切片宜分钟才能达到内部，因此切片宜薄不宜厚。薄不宜厚。44（二）缓冲液的选择和调节机制二）缓冲液的选择和调节机制1 1、缓冲液的作用：、缓冲液的作用：缓冲液具有缓冲液具有缓冲缓冲机体外来少量强酸和少量强机体外来少量强酸和少量强碱而碱而不易引起溶液不易引起溶液pHpH值改
34、变的作用值改变的作用。所以组织化。所以组织化学孵育液或染液都必须用缓冲液配制，以保证其学孵育液或染液都必须用缓冲液配制，以保证其适宜的适宜的pHpH值。值。缓冲液之所以具有缓冲作用，是因为缓冲液之所以具有缓冲作用，是因为它同时它同时含有足量的对抗外来强酸和强碱的组分含有足量的对抗外来强酸和强碱的组分。这种成。这种成对的物质组分，合称为对的物质组分，合称为缓冲系或缓冲对缓冲系或缓冲对。缓冲液。缓冲液就是由缓冲对组成的液体，例如磷酸二氢钠和磷就是由缓冲对组成的液体，例如磷酸二氢钠和磷酸氢二钠这组缓冲对组成了磷酸缓冲液。酸氢二钠这组缓冲对组成了磷酸缓冲液。452 2、缓冲液的种类与选择、缓冲液的种类
35、与选择 酶组织化学所需缓冲液种类很多，常用的有酶组织化学所需缓冲液种类很多，常用的有醋酸缓冲液醋酸缓冲液、磷酸缓冲液磷酸缓冲液、TrisTris缓冲液缓冲液和和二甲砷酸缓冲液二甲砷酸缓冲液等。等。使用时可根据所要显示的酶类，选择使用不同的缓冲液。使用时可根据所要显示的酶类，选择使用不同的缓冲液。如有钙离子存在时，最好不用磷酸缓冲液，不然易发生非酶如有钙离子存在时，最好不用磷酸缓冲液，不然易发生非酶反应；反应；TrisTris是属于是属于氨基的缓冲液氨基的缓冲液，因，因氨基氨基与与醛基醛基易发生化学易发生化学反应，故二者不能在一起使用。反应，故二者不能在一起使用。PBTris-CHOCa2+46
36、（三）温度对酶反应速度的影响三）温度对酶反应速度的影响酶促反应也有一个酶促反应也有一个最适温度，最适温度，在最适在最适温度的两侧其反应温度的两侧其反应速度都比较低。人速度都比较低。人体组织细胞中最适体组织细胞中最适温度一般为温度一般为3737左左右。部分酶反应在右。部分酶反应在430430之间仍之间仍存有酶活性反应，存有酶活性反应，但其反应速度常是但其反应速度常是缓慢的。缓慢的。47（四）四）pHpH值对酶反应的影响值对酶反应的影响1、最最适适pH值值：pH值值在在酶酶反反应应过过程程中中有有着着极极其其重重要要的的影影响响。在在一一定定pH值值下下，酶酶促促反反应应具具有有最最大大速速度度，
37、称称此此pH值值为为酶酶促促反反应应最适最适pH值值（optimal pH）。以以最最适适pHpH值值为为中中心心，高高于于或或低低于于最最适适pHpH值值时时，酶酶反反应应速度均下降。速度均下降。48最适最适pHpH值有时可因值有时可因底物种类、浓度及缓冲液的类型底物种类、浓度及缓冲液的类型的的不同而产生改变，最适不同而产生改变，最适pHpH值不是一个常数。大多数酶值不是一个常数。大多数酶的最适的最适pHpH值是在内环境的值是在内环境的pHpH值范围内。值范围内。2 2、几种酶的、几种酶的pHpH值：值：493 3、pHpH值影响酶活性的原因值影响酶活性的原因（1 1）pHpH过低或过高均会
38、影响酶分子的过低或过高均会影响酶分子的构型构型，甚至使，甚至使酶酶变性、失活变性、失活。（2 2）酶的活性中心一般只有一种离解状态最有利于）酶的活性中心一般只有一种离解状态最有利于底物结合，在此底物结合，在此pHpH值下，酶活性最高，是最适值下，酶活性最高，是最适pHpH值。值。（3 3）pHpH值会影响值会影响底物、酶底物复合物底物、酶底物复合物的离解状态。的离解状态。50（五）捕捉剂五）捕捉剂 capture在酶组织化学反应过程中，捕捉剂对酶反应结果在酶组织化学反应过程中，捕捉剂对酶反应结果具有极其重要的作用。捕捉剂是十分严格的，具有极其重要的作用。捕捉剂是十分严格的，没没有捕捉剂就不能形
39、成最终产物有捕捉剂就不能形成最终产物，而且它既能促使而且它既能促使高效率地进行反应，又不剧烈地损害酶的活性。高效率地进行反应，又不剧烈地损害酶的活性。捕捉剂有捕捉剂有PbPb2+2+、CuCu2+2+、BaBa2+2+等，等，PbPb2+2+已广泛应用于已广泛应用于磷酸酶、酯酶和转移酶等酶反应中。磷酸酶、酯酶和转移酶等酶反应中。底物（底物（S）IRP FRP酶分解酶分解捕捉剂捕捉剂不溶性不溶性可溶性可溶性Pb、Cu、Ba51优点优点缺点缺点1 1、在酸性、中性、碱性、在酸性、中性、碱性的广泛领域内均可使用的广泛领域内均可使用1 1、PbPb2+2+本身可以和反应本身可以和反应产物局部以外部位结
40、合产物局部以外部位结合扩散，也具有吸附扩散，也具有吸附作用。作用。2 2、无论是、无论是PbSPbS或或Pb(POPb(PO4 4)2 2，其反应物在光镜下均其反应物在光镜下均可见可见3 3、电镜细胞化学虽经脱、电镜细胞化学虽经脱水、包埋等过程酶活性水、包埋等过程酶活性有轻度流失，但仍具有有轻度流失，但仍具有较好的电子密度。较好的电子密度。2 2、PbPb2+2+本身又是抑制剂，本身又是抑制剂，对腺苷酸环化酶和尿苷对腺苷酸环化酶和尿苷酸环化酶具有抑制作用。酸环化酶具有抑制作用。Pb2+作为捕捉剂的优缺点作为捕捉剂的优缺点52（六）激活剂六）激活剂 activator 凡凡是是能能提提高高酶酶活
41、活性性的的物物质质，都都称称为为激激活活剂剂。激激活活剂剂的种类较多，可分为三大类：的种类较多，可分为三大类：1 1、离离子子：多多为为金金属属离离子子。有有时时一一种种激激活活剂剂对对某某种种酶酶能能起起激激活活作作用用，对对另另一一种种酶酶可可能能起起抑抑制制作作用用；有有时时离离子子间间也也有有拮拮抗抗现现象象。如如NaNa+抑抑制制K K+的的激激活活作作用用；MgMg2+2+激激活活的的酶则常被所酶则常被所CaCa2+2+抑制。抑制。2 2、小小分分子子化化合合物物：某某些些还还原原剂剂，如如半半胱胱氨氨酸酸、还还原原型型谷谷胱胱甘甘肽肽等等能能使使酶酶分分子子中中的的双双硫硫键键还
42、还原原成成硫硫氢氢基基，从从而而提高酶活性。提高酶活性。3 3、激激活活酶酶：这这类类激激活活剂剂是是指指可可使使某某些些无无活活性性的的酶酶原原，变成有活性的酶。变成有活性的酶。53(七）抑制剂七）抑制剂 inhibitor 是是指指某某些些物物质质在在不不引引起起酶酶蛋蛋白白变变性性的的情情况况下下，使使酶酶活活性性减减弱弱，抑抑制制酶酶的的活活力力，甚甚至至消消失失，这这样样的的物质称为抑制剂。抑制剂一般可分为三种：物质称为抑制剂。抑制剂一般可分为三种：1 1、特特异异性性抑抑制制剂剂：作作用用于于酶酶分分子子中中的的活活性性基基团团，如毒扁豆碱，对乙酰胆碱酯酶的抑制作用。如毒扁豆碱，对
43、乙酰胆碱酯酶的抑制作用。2 2、非非特特异异性性抑抑制制剂剂：大大多多数数的的抑抑制制作作用用是是基基于于使使酶酶蛋蛋白白变变性性，如如加加热热对对所所有有酶酶均均有有一一定定的的破破坏坏作作用。用。3 3、常常用用的的抑抑制制剂剂：有有氟氟化化钠钠、氰氰化化钠钠、叠叠氮氮钠钠、硝酸镧、硫化钡、半胱氨酸、硝酸镧、硫化钡、半胱氨酸、EDTAEDTA等。等。54六、对照实验六、对照实验1 1、用用抑抑制制剂剂确确认认酶酶活活性性对对照照实实验验：用用酶酶活活性性的的抑抑制制剂剂确确认认酶酶活活性性受受到到抑抑制制，这这是是对对照照实实验验的的一一种种重要方法重要方法。2 2、除除去去底底物物对对照
44、照实实验验：用用去去底底物物的的孵孵育育液液进进行行反反应应，确确认认反反应应消消失失或或明明显显减减弱弱。这这是是一一种种常常用用的的酶组织化学反应的对照方法。酶组织化学反应的对照方法。3 3、阳阳性性对对照照实实验验：如如若若事事先先不不知知某某种种组组织织细细胞胞是是否否存存在在某某种种酶酶，但但已已知知肝肝细细胞胞的的溶溶酶酶体体中中含含有有此此种种酶酶，可可将将待待测测组组织织与与肝肝组组织织同同时时处处理理，两两者者相相比互为对照，以确认酶活性的存在。比互为对照，以确认酶活性的存在。554 4、改变孵育液中底物的对照实验：、改变孵育液中底物的对照实验：5 5、使酶活性丧失的对照实验
45、：、使酶活性丧失的对照实验：加长固定时加长固定时间或恒温间或恒温6060处理处理60min60min的方法，使酶活性的方法，使酶活性丧失后进行孵育反应。此种对照实验较少用，丧失后进行孵育反应。此种对照实验较少用，仅适用于某些耐受相当强的固定和高温的酶。仅适用于某些耐受相当强的固定和高温的酶。6 6、用酶的激活剂对照实验：、用酶的激活剂对照实验：使用酶的激活使用酶的激活剂，确认酶活性被增强，剂，确认酶活性被增强，少用少用。56小小 结结概述：概述：酶的概念、酶的命名和酶的分类。酶的概念、酶的命名和酶的分类。一、组织化学显示酶的方法：一、组织化学显示酶的方法：免疫组织化学、酶组织化学。免疫组织化学
46、、酶组织化学。二、酶组织化学的基本理论：二、酶组织化学的基本理论：酶定位、酶反应酶定位、酶反应三、光镜酶组织化学证明法：三、光镜酶组织化学证明法：金属金属-金属盐法、偶联偶氮色素金属盐法、偶联偶氮色素法、色素形成法。法、色素形成法。四、酶组织化学的基本条件：四、酶组织化学的基本条件：生物化学方面的要求、形态学生物化学方面的要求、形态学方面的要求、酶组织化学的局限性（定位、定性、定量）。方面的要求、酶组织化学的局限性（定位、定性、定量）。五、影响酶活性的基本条件：五、影响酶活性的基本条件：固定和切片标本的制作、缓冲固定和切片标本的制作、缓冲液的选择和调节机制、温度、液的选择和调节机制、温度、pHpH值对酶反应的影响、捕捉剂、值对酶反应的影响、捕捉剂、激活剂、抑制剂。激活剂、抑制剂。六、对照实验：六、对照实验：57