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1、酶酶 的的 组组 织织 化化 学学Enzyme histochemistry一一.概述概述l酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质l高效性高效性 103-106倍倍l专一性专一性l低反应条件低反应条件l易变性失活易变性失活l降低生化反应的反应活化能降低生化反应的反应活化能酶活性的检测方法酶活性的检测方法广义上说，任何一种可以测定反应物变化速广义上说，任何一种可以测定反应物变化速度的分析技术，都可用来测定酶活性度的分析技术，都可用来测定酶活性l容量法（量气法）容量法（量气法）l比色法与分光光度法比色法与分光光度法l荧光法与同位素法荧光法与同位素法l离子选择电极法
2、，旋光法离子选择电极法，旋光法l分子生物学，免疫化学法等分子生物学，免疫化学法等酶的组织化学酶的组织化学l 利用细胞内的酶具有催化底物利用细胞内的酶具有催化底物的特性，并通过显色反应在切片的特性，并通过显色反应在切片或涂片上显示组织或细胞中内源或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及其定位的方法性酶的活性及其定位的方法 酶组织化学发展历史酶组织化学发展历史1.1868年年 Klebs 组化组化2.1939年年 Takamatsu、Gomori 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 1940-1960年年3.电镜酶组织化学电镜酶组织化学 1955年年 Scheldon 酸性磷酸酶酸性磷酸酶4.免疫酶组织化学免疫
3、酶组织化学 1970年年 Sternberger 酶标抗体法酶标抗体法目前，用酶组织化学方法能显示的酶已达目前，用酶组织化学方法能显示的酶已达100余种余种 酶的种类酶的种类 1.氧化还原酶氧化还原酶 2.转移酶转移酶 3.水解酶水解酶 4.裂解酶裂解酶 5.异构酶异构酶 6.合成酶合成酶二二.酶组织化学反应的基本知酶组织化学反应的基本知识识l酶的特性酶的特性l酶的定位酶的定位l酶组织化学的基本原理酶组织化学的基本原理（一）酶的特性（一）酶的特性1.水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂剂2.有机溶剂不同程度降低酶的活性有机溶剂不同程度降低酶的活性3.易受温度影
4、响，对热耐受性弱易受温度影响，对热耐受性弱4.对干燥耐受性强对干燥耐受性强（二）酶的定位（二）酶的定位l 酶在细胞内或超微结构中存在的特定部酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位位l 5-核苷酸酶核苷酸酶浆膜浆膜 ATPase肌球蛋白肌球蛋白 细胞膜细胞膜 线粒体线粒体(三）酶组化的基本条件三）酶组化的基本条件l 同时保存结构和酶的活性同时保存结构和酶的活性l 保存酶的定位，防止酶的扩散或移位保存酶的定位，防止酶的扩散或移位l 保证反应产物的特异性保证反应产物的特异性*影响酶活性的因素：影响酶活性的因素：温度温度 PH值值 抑制剂抑制剂 激活剂激活剂（四）原理及一般原则（四）原理及一般原则1.基
5、本原理基本原理l 细胞内的酶催化分解合适的底物，生成细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物（即初级反应产物）中间产物（即初级反应产物）l 然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反应，生成有色不溶性的终反应产物反应，生成有色不溶性的终反应产物l 该反应产物沉积在原位，以显示酶的存该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在在l第一反应：酶促反应第一反应：酶促反应 底物底物 初级反应产物（初级反应产物（PRP）l第二反应：捕捉反应第二反应：捕捉反应 PRP+捕捉剂捕捉剂 终反应产物终反应产物（FRP）酶酶*PRP弥散：弥散：1.底物在酶催化下水解的速度底物在酶催化下水解的
6、速度 2.PRP在缓冲液中的弥散系数在缓冲液中的弥散系数 3.PRP与辅助物反应的速度与辅助物反应的速度 应选择合适的底物和辅助物应选择合适的底物和辅助物,减少弥散减少弥散 捕捉剂的浓度捕捉剂的浓度 （1mg/ml）2.一般原则一般原则1.对组织处理对组织处理,制片过程不能影响酶的活性及制片过程不能影响酶的活性及分布分布2.所选底物和辅助物必须迅速所选底物和辅助物必须迅速,同步穿透入组同步穿透入组织和细胞中织和细胞中3.所选底物最好只能被一种酶催化分解所选底物最好只能被一种酶催化分解4.所选辅助物不影响细胞内酶的活性所选辅助物不影响细胞内酶的活性,不影响不影响其他反应试剂的穿透性其他反应试剂的
7、穿透性5.PRP必须迅速与辅助物反应必须迅速与辅助物反应,FRP为水不溶为水不溶性的有色稳定产物性的有色稳定产物6.所有参与反应的试剂均不能与其他成分吸附所有参与反应的试剂均不能与其他成分吸附或结合或结合(五五)酶组织化学的主要步骤酶组织化学的主要步骤 1.酶的固定酶的固定 （fixation）2.酶的特异性反应酶的特异性反应 （specific reaction）3.在最适条件下在最适条件下,酶反应产物的沉着酶反应产物的沉着（precipitation）4.使沉着物具有可见性使沉着物具有可见性 （visualization）组织组织/细胞细胞 制作切片制作切片 酶反应（孵育）酶反应（孵育）显
8、色显色 封片封片 镜检镜检（六）各步骤注意问题（六）各步骤注意问题1.检测方法的选择检测方法的选择2.酶的保存与固定酶的保存与固定 一般新鲜组织快速冷冻一般新鲜组织快速冷冻,冰冻切片冰冻切片 -70长期保存长期保存 固定剂固定剂 1-4%多聚甲醛多聚甲醛,福尔马林福尔马林,戊二醛戊二醛 固定时间固定时间 固定方法固定方法:浸泡固定浸泡固定 灌流固定灌流固定 固定温度固定温度:04（六）各步骤注意问题（六）各步骤注意问题3.切片制作切片制作:切片厚度切片厚度40um4.缓冲液选择缓冲液选择l 缓冲液用于缓冲液用于 A.配置固定液配置固定液 B.漂洗液漂洗液 C.配置酶反应孵育液配置酶反应孵育液l
9、 选择缓冲液应注意选择缓冲液应注意 A.不能减弱目标酶的活性不能减弱目标酶的活性 B.不能含有与捕捉机制相同的物质不能含有与捕捉机制相同的物质 C.注意漂洗用缓冲液的渗透压注意漂洗用缓冲液的渗透压 D.漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同（六）各步骤注意问题（六）各步骤注意问题5.孵育反应孵育反应 A.孵育液配置孵育液配置 B.孵育的温度和时间孵育的温度和时间:37 15-30min C.切片孵育法切片孵育法 -切片孵育切片孵育 -漂浮孵育漂浮孵育（六）各步骤注意问题（六）各步骤注意问题6.酶特异性对照实验酶特异性对照实验 用酶活性抑制剂用酶活性
10、抑制剂 采用无底物的孵育液采用无底物的孵育液 过固定或加热过固定或加热 用针对目标酶的激活剂用针对目标酶的激活剂 改变孵育液底物改变孵育液底物 选择最适选择最适PH 酶细胞内的定位差异酶细胞内的定位差异（六）各步骤注意问题（六）各步骤注意问题7.孵育后操作孵育后操作 光镜光镜:酶孵育后进行后固定酶孵育后进行后固定 脱水脱水 封片封片,镜检镜检 电镜电镜:孵育后孵育后,后固定后固定 脱水脱水 超薄切片超薄切片 后染后染色色 电镜检查电镜检查（六）各步骤注意问题（六）各步骤注意问题8.人为产物及其原因人为产物及其原因l 酶或与检测有关物质的扩散酶或与检测有关物质的扩散l 最终反应产物的扩散最终反应
11、产物的扩散l 吸附现象吸附现象l 反应阴性反应阴性三三.显示酶的组织化学方法显示酶的组织化学方法（一）金属离子沉淀法（一）金属离子沉淀法 一般用于显示磷酸酶一般用于显示磷酸酶1.钙钴法钙钴法-甘油磷酸钠甘油磷酸钠 磷酸酯磷酸酯+Ca+磷酸钙磷酸钙 磷酸钴磷酸钴 硫化钴硫化钴（黑色沉淀）（黑色沉淀）酶底物酶底物 PRP（磷酸）磷酸）+某金属某金属 金属金属 显色显色 与底物混合液中与底物混合液中 置换置换 某金属离子结合某金属离子结合AKPCo+硝酸钴硝酸钴硫化胺硫化胺酶酶2.Gomori 硝酸铅法硝酸铅法-甘油磷酸钠甘油磷酸钠 磷酸酯磷酸酯+铅铅 磷酸铅磷酸铅 硫化铅硫化铅（黑色沉淀）（黑色沉
12、淀）酶底物酶底物 PRP（磷酸）磷酸）显色反应显色反应 与底物混合液中与底物混合液中 金属离子结合金属离子结合 ACP硫化胺硫化胺 酶酶 直接沉着直接沉着 （二）偶氮偶联法（偶氮色素法）（二）偶氮偶联法（偶氮色素法）1.原理原理底物混合液底物混合液 PRP与与 不溶性不溶性 重氮盐结合重氮盐结合 偶氮色素偶氮色素2.方法方法 同时偶联法同时偶联法 后偶联法后偶联法酶酶 偶氮偶联偶氮偶联3.常用底物常用底物 萘酚萘酚AS-BI 萘酚萘酚AS-D 萘酚萘酚AS-MX 萘酚萘酚AS-TR 常用重氮盐常用重氮盐 坚牢兰坚牢兰RR 坚牢兰坚牢兰B 坚牢红坚牢红RC 坚牢红坚牢红TR 坚牢紫坚牢紫B 六偶
13、氮副品红六偶氮副品红 六偶氮新品红六偶氮新品红4.举例举例-萘基磷酸钠萘基磷酸钠 磷酸氢二钠磷酸氢二钠+-萘酚萘酚-萘酚萘酚+坚牢兰坚牢兰 偶氮染料沉淀偶氮染料沉淀5.应用应用 可显示可显示ALPase,ACPase,酯酶酯酶,转肽酶转肽酶,肽酶肽酶,-葡糖苷酶等葡糖苷酶等磷酸酶磷酸酶(三三)联苯胺色素法联苯胺色素法l 用于显示过氧化物酶用于显示过氧化物酶l 原理原理:无色联苯胺无色联苯胺 有色联苯胺有色联苯胺过氧化物酶过氧化物酶,H2O2 脱氢脱氢(DAB)联苯胺褐联苯胺褐(四四)四唑盐法四唑盐法用于显示氧化酶和脱氢酶用于显示氧化酶和脱氢酶原理原理:四唑盐或双四唑盐四唑盐或双四唑盐 氢离子氢
14、离子 与与 与与 底物混合液底物混合液 无色四唑盐结合无色四唑盐结合 红色或兰色的沉淀红色或兰色的沉淀 脱氢酶脱氢酶 +2H被还原被还原l常用四唑盐种类常用四唑盐种类 三苯四唑氯化物三苯四唑氯化物 TTC 蓝四唑盐蓝四唑盐 BT 新四唑盐新四唑盐 NT 四唑氮蓝四唑氮蓝 NBT 四氮四唑盐氯化物四氮四唑盐氯化物 TNBT(五五)靛蓝反应靛蓝反应l原理原理:底物被酶分解为二个初级反应产底物被酶分解为二个初级反应产物物,其中之一可在一定条件下形成不溶其中之一可在一定条件下形成不溶性的靛蓝性的靛蓝l应用应用:可显示胆碱酯酶、磷酸酶、糖苷可显示胆碱酯酶、磷酸酶、糖苷酶、非特异性酯酶酶、非特异性酯酶l例如：例如：吲哚酚酯吲哚酚酯 吲哚酚吲哚酚+RCOOH 吲哚酚吲哚酚 靛蓝（兰色沉淀）靛蓝（兰色沉淀）酯酶酯酶+水水氧化作用氧化作用 O2四四.酶组织化学的应用酶组织化学的应用1.了解组织、细胞的代谢活动了解组织、细胞的代谢活动2.细胞类型的判断细胞类型的判断3.了解细胞定位了解细胞定位4.用于肿瘤的研究用于肿瘤的研究5.用于免疫组化和杂交组化的显示手段用于免疫组化和杂交组化的显示手段