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1、基因工程病毒疫苗苏州大学医学部贡成良第一节疫苗概述第一节疫苗概述 一、疫苗的起源与发展一、疫苗的起源与发展1、起源阶段、起源阶段Dr Edward Jener（1796）：）：用一种奶牛痘感染人类，感染后不再被天花感染。用一种奶牛痘感染人类，感染后不再被天花感染。Louis Pasteur （19世纪末）：世纪末）：研制成功狂犬疫苗。研制成功狂犬疫苗。1978 1978 年世界卫生组织宣布，人类消灭了天花。年世界卫生组织宣布，人类消灭了天花。Salmon&Smith Salmon&Smith 伤寒细菌灭活疫苗伤寒细菌灭活疫苗.ChamberlaiChamberlai&Roux&Roux 霍乱、
2、鼠疫灭活疫苗霍乱、鼠疫灭活疫苗爱德华首先采用接种牛痘预防天花爱德华首先采用接种牛痘预防天花一、疫苗的起源与发展一、疫苗的起源与发展2、发展阶段、发展阶段（1）20世纪前世纪前30年年卡介苗（卡介苗（BCG）：结核菌减毒苗）：结核菌减毒苗白喉白喉/破伤风疫苗：化学灭活疫苗破伤风疫苗：化学灭活疫苗流感疫苗：禽胚中研制成功流感疫苗：禽胚中研制成功（2）二次世界大战后：）二次世界大战后：多种减毒和灭活病毒疫苗研制成功：脊髓灰质炎疫多种减毒和灭活病毒疫苗研制成功：脊髓灰质炎疫苗、腮腺炎疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗以及脑膜苗、腮腺炎疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗以及脑膜炎球菌、肺炎球菌、流感杆菌疫苗炎球菌、肺炎球菌
3、、流感杆菌疫苗一、疫苗的起源与发展一、疫苗的起源与发展3、20世纪80年代（分子技术推动的疫苗研制）重组乙肝疫苗细菌荚膜与载体蛋白偶联疫苗细胞培养生产减毒或灭活疫苗4、我国的情况北京、上海、兰州、成都、长春、武汉生物制品研究所实现计划免疫接种二、疫苗与基因工程疫苗1、疫苗（Vaccine)（1）传统的定义：用人工变异或从自然界筛选获得的减毒或无毒的活的病原微生物制成的制剂，或者用理化方法将病原微微生物杀死制备的生物制剂，用于人工自动免疫，使人或动物产生免疫能力。二、疫苗与基因工程疫苗2、现代定义：是致病原的蛋白（多肽或肽）、多糖、或核酸，以单一成份或含有有效成份复杂颗粒的形式，或通过活的减毒致
4、病原或载体，进入机体后能产生灭活、破坏或抑制病原的特异性免疫应答。国际上一般将细菌性制剂、病毒性制剂以及类毒素统称为疫苗二、疫苗与基因工程疫苗3、第一代疫苗通过改变培养条件，或在不同寄主动物上传代使病原微生物毒性减弱。或通过物理化学的方法将其灭活来完成的。4、第二代疫苗（基因工程疫苗）利用DNA重组技术克隆并表达保护性抗原基因，利用表达的抗原产物或重组体本身制成的疫苗。（1）获得大量高纯度的抗原（2）安全第二节病毒疫苗的种类一、传统病毒疫苗1、灭活疫苗（死疫苗）：诱导产生IgG和IgM（1）优点：工艺简单免疫原性稳定易于制备（2）缺点保证不含有灭活不完全的颗粒；提供的免疫力短、常有不良过敏反应
5、；不能诱生局部免疫抗体IgA,野生病毒仍可以到达侵入门户。2.减毒疫苗(弱毒疫苗）（1）定义：微生物的自然强毒株通过物理、化学的和生物学的方法，连续传代，使其对原宿主丧失致病能力，或只引起亚临床感染，但仍能保持良好的免疫原性、遗传特性，用这种毒株的疫苗。（2）优点：可以诱发全面的免疫反应（体液免疫、细胞免疫）免疫力持久（3）减毒方法体外减毒：异源宿主中连续传代或单一宿主中反复连续传代。冷适应筛选：将病毒在低温下连续或逐步传代，诱导病毒基因组多处突变或损伤，获得毒力减弱和各种标志特征的冷适应株，以此制备的疫苗。3.亚单位疫苗（1）定义：提取或合成细菌、病毒外壳的特殊蛋白结构，即抗原决定簇制成的疫
6、苗。（2）优点：副作用小、不含核酸、安全性高4.衡量疫苗能否投入使用的标准衡量疫苗能否投入使用的标准l安全性安全性 删除致病基因，保留抗原性。删除致病基因，保留抗原性。l有效性有效性 尽可能调动肌体细胞免疫和体液尽可能调动肌体细胞免疫和体液免疫。免疫。5.免疫反应过程免疫反应过程抗原抗原 抗原显示细胞吞噬抗原抗原显示细胞吞噬抗原 抗原肽抗原肽MHC蛋白蛋白 抗原肽复合物抗原肽复合物 T细胞活化细胞活化免疫细胞识别、活化免疫细胞识别、活化 B细胞活化细胞活化活化活化T细胞细胞 杀伤性杀伤性T细胞细胞 活化活化B细胞细胞 释放淋巴因子释放淋巴因子 分泌抗体分泌抗体 杀灭抗原杀灭抗原二、新一代病毒疫
7、苗（遗传重组疫苗）二、新一代病毒疫苗（遗传重组疫苗）（一）基因工程疫苗（一）基因工程疫苗定义：通过基因工程表达保护性抗原基因，定义：通过基因工程表达保护性抗原基因，利用表达产物或重组体本身制成的疫苗。利用表达产物或重组体本身制成的疫苗。种类：基因工程亚单位疫苗、载体疫苗、种类：基因工程亚单位疫苗、载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工程疫核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗苗1：基因工程亚单位疫苗：基因工程亚单位疫苗（1 1）定义：用基因工程表达的蛋白抗原纯化后制作）定义：用基因工程表达的蛋白抗原纯化后制作的疫苗。的疫苗。（2 2）优点：）优点：产量大产量大纯度高纯度高免疫原性好免疫原性
8、好安全性高安全性高（3）制备亚单位疫苗的前提：制备亚单位疫苗的前提：鉴别出什么成分引起宿主免疫反应。鉴别出什么成分引起宿主免疫反应。（4）提高免疫效果的方法不同基因组合、使表达成颗粒性结构；在体外加以聚团化，包入脂质体或胶囊微球；加入免疫增强剂（佐剂）；2.基因工程载体疫苗（1）定义：将免疫原基因与载体DNA连接的重组载体转入受体获得增殖培养物供疫苗制备，或直接将活载体接种宿主，直接在体内表达抗原诱导免疫反应。（2）优势：多为活载疫苗，抗原无需纯化、载体本身有佐剂的作用；常用的载体有：痘病毒、腺病毒、脊灰病毒、霍乱弧菌、沙门菌、卡介苗；多价或多联疫苗：同时表达多种抗原（3）非复制型载体重组微生
9、物进入机体后，只保留DNA的复制、转录与表达，但不产生感染性后代；（4）复制型载体的制作方法利用在人体中不能繁殖的动物病毒；（例杆状病毒）通过DNA技术对微生物进行改造，使不能在人体中繁殖后代，但表达源基因的能力仍保留。3.基因缺失活疫苗定义：通过基因操作将病原微生物中与致病性有关的毒定义：通过基因操作将病原微生物中与致病性有关的毒力基因缺失，使之成为无毒株或弱毒株，但仍保持良好力基因缺失，使之成为无毒株或弱毒株，但仍保持良好的免疫原性的免疫原性4.DNA疫苗（第三代免疫）疫苗（第三代免疫）lWolf（1993）将流感病毒核蛋白）将流感病毒核蛋白P抗原基因直接注射抗原基因直接注射到小鼠骨骼肌引
10、起免疫反应，产生多种亚型到小鼠骨骼肌引起免疫反应，产生多种亚型TK细胞。细胞。l目前已经进行的研究：目前已经进行的研究：轮状病毒、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺轮状病毒、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、狂犬病毒、结核杆菌亚单位疫苗等。陷病毒、狂犬病毒、结核杆菌亚单位疫苗等。（1）二个特点：）二个特点：DNA（带有免疫原基因）、可起免疫作（带有免疫原基因）、可起免疫作用用（2）优点：无感染性诱发产生天然抗原表位的抗体诱发特异性T细胞免疫反应持续免疫便于构建多价疫苗稳定性不受温度影响纯化容易有预防和免疫治疗双重功能可快速筛选具有免疫保护效果的基因能定向诱导辅助性T细胞(TH1
11、、TH2)为主导的免疫反应5.蛋白工程疫苗定义：对抗原基因进行改造或不同抗原基因进行组合，以期达到增强其产物的免疫原性、扩大反应谱、去除有害作用或副反应的一类疫苗（二）、遗传重组疫苗（二）、遗传重组疫苗l利用遗传重组的方法获得的重组微利用遗传重组的方法获得的重组微生物制成的疫苗。生物制成的疫苗。（三）合成肽疫苗（三）合成肽疫苗又称表位疫苗：利用化学合成的方又称表位疫苗：利用化学合成的方法合成能诱发机体产生保护的多肽法合成能诱发机体产生保护的多肽所制作的疫苗所制作的疫苗（四）抗独特型抗体疫苗（1）独特型：抗体分子与抗原结合的高变区的独特结构（2）抗独特型抗体疫苗：使用与特定抗原免疫原性相近的抗抗
12、体（Ab2）作抗原制成的疫苗（内影像疫苗）（五）微胶囊疫苗（可控缓释疫苗）（1）用微胶囊技术将特定的抗原包裹后制成的疫苗。（2）微胶囊：丙交酯和乙交酯的共聚物制成，可干燥成粉状颗粒。第三节基因工程病毒疫苗的设计与制备一、设计策略1、理想疫苗的特点：有效、安全产生免疫快可大量生产贮存运输方便价格合理2、亚单位疫苗设计策略（1）抗原选择能模拟诱生有效保护性抗体应答的抗原决定簇具有优势免疫的抗原决定簇对人体安全特异性（2）表达载体及表达系统（按需要选择）3、基因工程载体疫苗的设计策略（1 1）抗原选择：）抗原选择：同上同上（2 2）疫苗载体的选择）疫苗载体的选择选择非致病性细菌或病毒作疫苗载体。选择
13、非致病性细菌或病毒作疫苗载体。A A：理想疫苗载体的条件：理想疫苗载体的条件：感染靶细胞感染靶细胞诱导机体产生免疫反应诱导机体产生免疫反应无毒力返祖：在不断繁殖过程中出现自身修复（毒力回复）无毒力返祖：在不断繁殖过程中出现自身修复（毒力回复）无大量排毒引起的环境污染无大量排毒引起的环境污染生活史中不能与宿主染色体整合生活史中不能与宿主染色体整合操作方便操作方便接种后不会长期在体外存留接种后不会长期在体外存留B常见的疫苗载体痘苗病毒载体痘苗病毒载体流感病毒载体流感病毒载体Mengo 病毒载体病毒载体金丝雀痘病毒载体金丝雀痘病毒载体仙苔病毒载体仙苔病毒载体疱疹病毒载体疱疹病毒载体沙门菌沙门菌卡介苗
14、卡介苗病毒载体细菌载体4、基因缺失活疫苗的设计l关键：选择要删除的靶基因，一般为复制非必需、毒力相关的基因5、核酸疫苗的设计策略基因选择：主要保护性抗原基因分子佐剂：增强核酸疫苗激发免疫应答反应的细胞因子表达载体：表达抗原能力强的载体（启动子、增强子、polyA信号二、基因工程疫苗制备的技术路线1、基因工程亚单位疫苗制备的技术路线抗原基因选择与分离构建重组载体转化宿主（细胞）表达、纯化2、基因工程载体疫苗制备技术路线抗原基因选择与分离插入疫苗载体系统（细菌或病毒）重组载体体外培养收获培养物及后处理3、基因缺失活疫苗制备技术路线选择靶基因定向缺失靶基因基因缺失毒株的培养收获病毒及后处理4、核酸疫
15、苗制备技术路线目的抗原基因的选择与分离构建表达质粒转入宿主细胞扩增纯化重组质粒后处理三、基因工程病毒疫苗的质量控制（1）注意：抗原基因、表达载体的变异和稳定性安全要求：重组后的基因产物无致病性、无毒性、无潜在危险有效性要求：保证表达后的蛋白具有良好的抗原性和免疫原性稳定性和重复性要求：同样的方法可以重复生产和制造（2）研制阶段的要求：插入基因：所有的背景清楚、克隆过程清楚载体：背景（启动子、复制子、抗药性等）清楚宿主细胞：背景（来源、表型、遗传型及相应的标记基因）清楚第四节基因工程病毒疫苗的研发现状一、需研制的基因工程病毒疫苗艾滋病乙型肝炎丙型肝炎戊型肝炎EBV肝炎人乳头瘤病毒（宫颈癌）单纯疱
16、疹病毒巨细胞病毒呼吸道合胞病毒轮状病毒登革热病毒埃博拉病毒二、重要病毒性疾病基因工程疫苗的研究进展1、艾滋病疫苗（AIDS）艾滋病全称艾滋病全称“获得性免疫缺陷综合症获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome)”，简称，简称AIDS。1981年，首例艾滋病病例在美国同性恋人群中发年，首例艾滋病病例在美国同性恋人群中发现。现。“人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency virus，HIV)”并确定艾滋病是由这种逆转录病毒并确定艾滋病是由这种逆转录病毒(retroviruses)所引起。所引起。The trans
17、mission route of HIV-1 in ChinaSHANXIFUJIANXIZHANGHEILONGJIANGJILINLIAONINGNEIMENGGUBeijingTian JinQINGHAIHEBEININGXIAGANSUSHAN XIANHUIHENANSHANDONGShang HaiJIANGXIHUBEIJIANGSUHUNANGUANGDONGGUANGXIGUIZHOUHAINANYUNNANSICHUANTAIWANXINJIANGChong QingZHEJIANGCRF07-BCBCRF01-AEB传入我国C传入我国CRF08-BCRisk Facto
18、rs for Cumulative HIV/AIDS cases in China(1985-2004)Blood/productsMTCTBlood collectionHetero/Homo sex采血采血29.6%29.6%血液血液/血制品血制品3.1%3.1%异性异性/同性同性8.2%8.2%静注毒品静注毒品42.0%42.0%母婴传播母婴传播1.0%1.0%IDUsOthers不详不详16.1%16.1%lHIV病毒在病毒在RNA基因组通过逆转录酶逆转录基因组通过逆转录酶逆转录为为DNA时时,容易发生误差。容易发生误差。l在与体内免疫系统相互作用的过程中在与体内免疫系统相互作用的过程
19、中,HIV不断演化不断演化,结果产生病毒变异。变异的速度结果产生病毒变异。变异的速度非常快非常快l据测定据测定,HIV感染者体内每天至少产生感染者体内每天至少产生108变异病毒变异病毒,同一个体内不同病毒之间的差异同一个体内不同病毒之间的差异可达可达10%15%。（1）HIV的生物学A、病毒蛋白直径约直径约100nm的球状病毒的球状病毒,粒子外包被着由两层脂质构成的脂膜粒子外包被着由两层脂质构成的脂膜,(主要是主要是gp41和和gp120)的脂质源于寄主细胞的质膜。的脂质源于寄主细胞的质膜。gp41：病毒衣壳的穿膜蛋白；：病毒衣壳的穿膜蛋白；gp120：病毒的主要衣壳糖蛋白，它与：病毒的主要衣
20、壳糖蛋白，它与HIV 成功成功感染有关。感染有关。P17：膜内侧面紧贴着蛋白质，核心部分是截去：膜内侧面紧贴着蛋白质，核心部分是截去头部的圆锥体，由蛋白质头部的圆锥体，由蛋白质P24所构成的衣壳包裹。所构成的衣壳包裹。蛋白质蛋白质P24和和P18组成其核心。组成其核心。反转录酶。其功能是催化病毒反转录酶。其功能是催化病毒RNA的反转录。的反转录。B、病毒基因lGag：编码衣壳蛋白：编码衣壳蛋白(Gag)lPol：病毒复制所必须的酶：病毒复制所必须的酶(Pol)lEnv：外膜糖蛋白：外膜糖蛋白(Env)。lTat：反式作用转录编码区：反式作用转录编码区 l rev：即抗阻遏物翻译区：即抗阻遏物翻
21、译区 lNef：长开放阅读框：长开放阅读框 lVif：短开放阅读框：短开放阅读框 l两个长末端重复序列两个长末端重复序列(LTR)C、HIV的复制与侵染细胞的过程（2）HIV疫苗研制l 由于由于HIV是逆转录病毒，故有人担心其核酸是逆转录病毒，故有人担心其核酸有可能导致细胞转化，完整病毒疫苗不宜有可能导致细胞转化，完整病毒疫苗不宜采用。所以研制采用。所以研制AIDS疫苗的主要探索应包疫苗的主要探索应包括：括：从病毒包膜中纯化糖蛋白抗原；从病毒包膜中纯化糖蛋白抗原；合成特异性抗原；合成特异性抗原；分离编码这些抗原的分离编码这些抗原的病毒基因组；病毒基因组；利用利用DNA重组技术产生适重组技术产生
22、适当的抗原。当的抗原。疫苗类型疫苗类型特点特点效果效果预防性疫苗预防性疫苗预防感染预防感染免疫个体不被野病毒感染免疫个体不被野病毒感染一级预防一级预防阻止发病阻止发病免疫个体被野病毒感染后维持在免疫个体被野病毒感染后维持在亚临床状态亚临床状态二级预防二级预防减少传播减少传播免疫个体被野病毒感染后血液中免疫个体被野病毒感染后血液中病毒载量明显低于未免疫个体，病毒载量明显低于未免疫个体，不易将病毒传给他人不易将病毒传给他人三级预防三级预防治疗性疫苗治疗性疫苗 免疫后使感染者返回或维持在亚免疫后使感染者返回或维持在亚临床感染状态临床感染状态多与药物多与药物合并使用合并使用传统疫苗形式减毒活疫苗灭活疫
23、苗病毒RNA反转录为DNARNA反转录DNA基因插入质粒PCR抗原基因克隆表达质粒质粒扩增与纯化质粒在菌内扩增质粒纯化提取转化基因工程技术与疫苗研制体内产生免疫原疫苗载体CHO,酵母,昆虫细胞体外免疫原制备HIV Vaccine Clinical Trials in China lIn 1993,United Biomedical Inc.conducted the first Phase I clinical trial of HIV vaccine in Yunnan province.lIn 2004,the second Phase I clinical trial of HIV vaccine(DNA prime/MVA boost,immunogen:CRF08-BC)was conducted in Guangxi province.lIn 2005,the third HIV vaccine(DNA prime/rTTV boost,immunogen:CRF07-BC)is under review by SFDA.lMore HIV vaccine are coming,including therapeutic vaccine.