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1、基因工程第六章第1页，本讲稿共35页 由DNA分子的体外重组，通过转化、转染、转导等适当途径引入宿主，会得到大量的重组体细胞或噬菌体。在这些众多的重组体中，会有多种类型的DNA分子，包括：不带任何外源DNA插入片段，仅由线性载体分子自身连接形成的环状DNA分子；由一个载体分子和一个或数个外源DNA片段构成的重组体DNA分子；单纯由数个外源DNA片段彼此连接形成的多聚DNA分子。第2页，本讲稿共35页 对于这些由混合的DNA制剂转化而来的大量的克隆群体，需要采用特殊的方法，才能选择和鉴定出可能含有目的基因的重组体克隆。目前已发展和应用了一系列重组体克隆检测法，包括遗传检测法、物理检测法、使用特异
2、性探针的核酸杂交法，以及免疫化学法等。第3页，本讲稿共35页 6.1 利用表型特征选择（遗传检测法）利用表型特征选择（遗传检测法）表型是指机体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。这里所说的供筛选用的表型特征来自两个方面：一个是克隆载体提供的，另一方面是插入的外源DNA序列提供的，前者应用较多。第4页，本讲稿共35页 6.1.1 利用载体提供的表型特征选择重组体分子利用载体提供的表型特征选择重组体分子 1.抗药性标记插入失活选择法抗药性标记插入失活选择法 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插入失活效应。例如在pBR322质粒的DNA序列上，编码有四环素抗性基因(Tetr)和氨苄青
3、霉素抗性基因(Ampr)，且在Tetr基因内有Bam HI和Sal I两种限制酶的单一切点。在这两个识别位点中的任何插入作用，都会导致Tetr基因出现功能性失活，因而根据AmprTets表型即可筛选出在Tetr基因内带有插入DNA片段的重组体细胞。第5页，本讲稿共35页第6页，本讲稿共35页 利用环丝氨酸富集法可以简化这种插入失活检测法的程序，该法可以使那些只带有原来质粒载体的细菌致死，从而抑制不含有插入DNA片段的载体分子形成转化子。例如：当外源DNA 插入在pBR322质粒的四环素抗性基因(Tetr)上，该基因便会立即失去它的功能作用，而另一种抗菌素抗性基因氨苄青霉素基因(Ampr)，则仍
4、然是完整的。将转化的细菌培养物移至含有氨苄青霉素的培养基中生长，经过这样的选择作用而得以存活下来的所有细胞，都应该带上了pBR322质粒分子。第7页，本讲稿共35页 在这些pBR322质粒分子中，有一部分是在其Tetr基因序列内具有DNA插入片段的重组质粒。把这种富集了的培养物作适当的稀释后，转接到含有四环素的培养基中生长，于是在其pBR322质粒分子的Tetr基因序列中带有DNA插入片段的所有细胞，都将停止生长（注意：四环素不会使细胞死亡，只是抑制细胞的生长）。最后加入环丝氨酸，就会促使所有正在生长着的细胞发生溶胞反应，那些没有发生溶胞反应而存活下来的细胞，大约有90100%都带有pBR32
5、2重组质粒，且在其Tetr基因上都含有一个插入的外源DNA片段，这些细胞可通过离心作用收集起来。第8页，本讲稿共35页 此外，在pBR322质粒的Ampr基因序列中，也有一个Pst I限制酶的唯一识别位点。Ampr基因正常情况下表达产生-内酰胺酶，在其作用下青霉素会变成青霉酮酸，当加入碘-青霉素指示液（30%I2，1.5%KI，5%青霉素G，0.05M的pH 6.4的磷酸缓冲液），AmprTetr菌落为无色透明。但当pBR322质粒的Ampr基因插入失活后，AmprTets菌落在碘-青霉素指示液中不褪色，仍呈碘的蓝灰色。根据菌落周围指示液颜色的改变与否，很容易鉴别出重组体菌落。第9页，本讲稿共
6、35页第10页，本讲稿共35页 这种方法的优点是无需把每一个转化子接种在Amp和Tet平板上，直接在转化平板上即可鉴定。其缺点是由于把指示液直接加入选择平板内，极易超成菌落之间的相互污染，给其后的鉴定带来困难。目前使用纸片法使这一方法得到了改善：预先将一定大小的纸片浸泡在指示液中，干燥后密闭保存，使用时只要将纸片覆盖在转化平板上，数分钟内就可以观察到结果。第11页，本讲稿共35页 2.-半乳糖苷酶显色反应选择法半乳糖苷酶显色反应选择法 将pUC质粒转化的细胞，培养在补加有X-gal和乳糖诱导物IPTG的培养基中时，由于基因内互补作用形成的有功能的半乳糖苷酶，会把培养基中无色的X-gal切割成半
7、乳糖和深蓝色的底物，使菌落呈现出蓝色反应。当pUC质粒载体的lacZ 序列插入了外源DNA片段时，会阻断读码结构，使其编码的肽失去活性，结果产生出白色的菌落。因此，根据这种-半乳糖苷酶的显色反应，便可以检测出含有外源DNA插入序列的重组体克隆。第12页，本讲稿共35页 6.1.2 利用插入序列提供的表型特征选择重组体分子利用插入序列提供的表型特征选择重组体分子 这种选择法要求所克隆的DNA片段是一个完整的序列，而且能够在大肠杆菌中实现功能的表达。其依据的基本原理是：转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码
8、的表型特征。例如小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）的分离：第13页，本讲稿共35页 先将含有DHFR-mRNA的小鼠总mRNA制剂反转录成cDNA拷贝，构建cDNA基因文库。根据小鼠DNFR对于药物三甲氧苄二氨嘧啶呈现抗性这种性状特征，将转化的细菌生长在含有三甲氧苄二氨嘧啶的培养基中（其含量水平为可以抑制大肠杆菌的DHFR的活性），选择转化子。这样分离出来的抗性克隆，显然都是由于具有小鼠DHFR基因的克隆片段，赋予寄主细胞新的抗性表型所致。第14页，本讲稿共35页 6.1.3 利用噬菌斑形态选择重组体分子利用噬菌斑形态选择重组体分子 把DNA包装成有活性的噬菌体颗粒，主要取决于两个因素：一是要具
9、有能被噬菌体包装蛋白和头部前体所识别的区域，即cos区；二是DNA的长度，只有重组体DNA是野生型 DNA的75105%的长度时，才能在培养平板上形成清晰的噬菌斑，而单一的载体DNA是不会包装成活的噬菌体颗粒的。第15页，本讲稿共35页 经体外包装，转导后能否形成清晰噬菌斑，尤其是对替换型载体，本身就是一种可利用的选择标记。另外cI基因插入失活后，会诱发溶源性细菌的原噬菌体进入溶菌周期，根据产生噬菌斑的清晰与混浊，也可以进行选择。第16页，本讲稿共35页 6.2 利用核酸杂交筛选利用核酸杂交筛选 从基因文库中筛选带有目的基因插入序列的克隆，最广泛使用的一种方法是核酸分子杂交技术。它所依据的原理
10、是放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针进行DNA-DNA或DNA-RNA杂交，利用同源DNA碱基配对的原则检测特定的重组克隆。第17页，本讲稿共35页 核酸杂交筛选法的最大优点是它可以普遍广泛地应用，尤其适合于大量群体的筛选，只要有现成可用的特异性探针，就可以有效地检测任何一种插入的外源DNA序列，而不以这种序列能否在大肠杆菌中实现基因表达为前提。第18页，本讲稿共35页 6.2.1 原位杂交筛选原位杂交筛选 生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑，按照其原来的位置不变地影印在硝酸纤维素滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，而将母板很好地保存起来。因为变性DNA同硝酸纤
11、维素滤膜有很强的亲和力，便在膜上形成DNA的印迹，在80下烘烤滤膜，使DNA牢固地固定下来。第19页，本讲稿共35页 用放射性同位素标记的RNA或DNA为探针同滤膜上的菌落所释放的变性DNA杂交，并用放射自显影技术进行检测，凡是含有与探针互补序列的菌落DNA，就会在X光胶片上出现曝光点。根据曝光点的位置，便可以从保留的母板上相应位置挑出所需要的阳性菌落或噬菌斑，这就是所需要的含有目的基因插入片段的重组体克隆。第20页，本讲稿共35页 6.2.2 核酸杂交检测的探针核酸杂交检测的探针 进行核酸分子杂交的前提是要有特定的DNA或RNA作探针。具有一定已知序列的核酸片段，大小通常为20kb左右，再带
12、上一定的探测标记，就构成了核酸探针。它可以通过分子杂交与待测基因的DNA序列结合，产生杂交信号，从而把待测基因的质和量显示出来。第21页，本讲稿共35页 1.放射性探针 广泛使用的探针，多是以32PdNTP为标记前体，通过缺口转移的方法，把天然DNA或RNA片段标记上放射性同位素。此外还可以化学合成DNA探针，只要已知目的基因产物的部分氨基酸序列，就可以从这个信息中，反推出基因编码区可能的核苷酸排列顺序。选择一小段含有独特密码子（Met和Try）或简并性最小的密码子（Cys、His、Phe和Tyr等）的氨基酸序列，用化学法合成出相当于这些密码子序列的寡核苷酸片段（1020个碱基）混和物；然后利
13、用多核苷酸激酶，将32PdNTP转移到合成的DNA的5-OH末端（称为末端标记），即成为标记好的探针。第22页，本讲稿共35页一个密码子：Met（甲硫氨酸）AUG Try （色氨酸）UGG二个密码子：Cys（半胱氨酸）His （组氨酸）Phe （苯丙氨酸）Try （酪氨酸）Lys （赖氨酸）第23页，本讲稿共35页 2.非放射性探针 由于32P放射性同位素半衰期只有14.3天，不易保存，且对人体有一定的损害，因而近年来又研制了非放射性物质标记核酸的方法，如糖基化探针、生物素探针、毛地黄苷标记等。用生物素标记DNA形成探针是目前用得较多的一种，它可以采用酶促或光促生物素来标记核酸。酶促法是利用缺
14、口转移的方法，但标记前体不是32PdTTP，而是用嘧啶环C5位连接了生物素的dTTP（或dUTP），它可以有效地掺入DNA中形成生物素探针。第24页，本讲稿共35页 光促法使用的试剂为光敏生物素乙酸盐，它是由光敏基团、连接臂和生物素组成的。光敏基团可在光照下活化，与核酸的碱基结合，连接臂可以降低生物素基团对核酸杂交的空间位阻；生物素用做标记物。将待标记的核酸（DNA或RNA）与光敏生物素乙酸盐混合，在近紫外的光源（如高压汞灯、碘钨灯）下照射1520分钟，就可将生物素标记在单链或双链的DNA或RNA上，形成稳定的共价结合。第25页，本讲稿共35页 标记好的生物素探针，可用于核酸的杂交反应，然后用
15、亲和素-酶系统来显示。亲和素可以特异地与生物素结合，酶可与底物反应进行显色或化学发光，这就相当于放射性同位素探针杂交后的放射自显影。最常用的工具酶是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。非放射性方法进行核酸杂交，其灵敏度不如放射性方法高，但非放射性探针具有安全、稳定、使用方便等优点，是一种正在发展很有前途的方法。第26页，本讲稿共35页 6.3 利用免疫学方法筛选利用免疫学方法筛选 免疫学方法专一性很强、灵敏度很高，其基本原理是：以目的基因在宿主细胞中的表达产物（多肽）作抗原，以该基因产物的免疫血清作抗体，通过抗原抗体反应将目的基因克隆检出。免疫学方法可以分为两种：即放射性抗体测定法和
16、免疫沉淀测定法。这些方法最突出的优点是，它们直接检测重组克隆所表达的蛋白产物，能够检测无任何可供选择的表型特征的重组克隆。当然这种方法必须具备有效的特异性抗体。第27页，本讲稿共35页6.3.1 放射性抗体测定法放射性抗体测定法 这一方法所依据的原理为：(1)一种免疫血清含有好几种特异性抗体（IgG），它们识别抗原分子上的不同定子，并分别同各自识别的抗原定子相结合；(2)抗体分子或抗体的F(ab)部分，能够十分牢固地吸附在固体基质（如聚乙烯等塑料制品）上，而不会被洗脱掉；(3)通过体外碘化作用，IgG抗体便会迅速地被放射性同位素125I标记上。第28页，本讲稿共35页 放射性抗体测定的主要程序
17、是：(1)首先把转化的菌落涂布在平板上，长出菌落以后，再影印到另一块平板上继续培养，并保留原来的平板作为母板；(2)待影印平板上的菌落长好后，置于含有氯仿饱和气体的容器中使菌落裂解，阳性菌落便释放出抗原；(3)将吸附了未标记IgG抗体的聚乙烯薄膜覆盖在平板表面，如果抗原与抗体具有对应关系，则在薄膜上形成抗原-抗体复合物；第29页，本讲稿共35页(4)取下聚乙烯薄膜，再用125I 标记的IgG处理，125I-IgG便会与结合在聚乙烯薄膜上的抗原决定簇结合；(5)漂洗聚乙烯膜除去过剩的125I-IgG，干燥后进行放射性自显影判断结果，并从母板上获得相应的重组克隆。第30页，本讲稿共35页第31页，
18、本讲稿共35页 对于能够分泌表达产物的重组体克隆，可以省去影印平板、裂解菌落等程序，操作更为简化。例如分泌胰岛素重组体克隆的筛选：第32页，本讲稿共35页第33页，本讲稿共35页 在放射免疫分析法基础上，最近又发展了一类非放射性免疫分析技术，例如荧光免疫分析、酶免疫分析以及化学发光免疫分析等。这些方法具有和放射免疫法相同的灵敏度和特异性，而且没有象同位素那样的半衰期短和安全防护问题，是一类很有发展前途的检测技术。第34页，本讲稿共35页 6.3.2 免疫沉淀测定法免疫沉淀测定法 相对于放射性免疫法，该方法灵敏度要低，而且易受干扰，但它的价值在于实验简便易行。其做法是：在生长菌落的琼脂培养基中，加入专门抗这种蛋白质分子的特异性抗体。如果有些菌落的细菌会分泌出某种蛋白质，那么在它的周围就会出现一条叫做沉淀素的抗体-抗原沉淀物所形成的白色的圆圈。第35页，本讲稿共35页