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1、含油污泥中石油降解菌的分离及其降解特性资源微生物实验室姓名：马腾飞时间：11月9日导师：晁群芳第二第二第三第三第四第四研究内容材料方法结果讨论研究结论汇报内容第一第一一、研究内容石油降解菌的分离菌株的鉴定最适降解条件降解特性研究二、材料与方法1.实验材料1.1含油污泥含油污泥样品来源于渤海油田钻井岩屑，取自中海油渤海公司环保技术服务分公司，经测定油泥的含水率为70.55%，pH为6.4,盐度3.0%。1.2培养基富集分离培养基斜面固体培养基含油液体培养基2.实验方法2.1降解菌的分离和形态观察利用富集培养基和斜面培养基对菌种进行分离纯化培养。将分离纯化培养得到的菌株使用扫描电镜进行形态观察。2
2、.2菌株的鉴定菌株采用16S rRNA基因序列分析的方法鉴定到属。2.3降解菌的最适降解条件测定采用单因素实验进行操作，分别改变温度、盐度和pH条件进行培养。2.4总石油烃（TPH）的降解TPH的测定采用超声萃取紫外分光光度法测定。2.5石油烃不同组分的降解 用二氯甲烷萃取添加菌液处理7d的含油污泥，用于硅胶柱层析，分别用30 mL正己烷、50 mL正己烷-二氯甲烷(体积比1:1)洗脱，所得到的饱和烃、芳香烃组分用事先称重的圆底烧瓶接取。计算石油烃降解菌对饱和烃和芳香烃的降解率。然后将称重后的芳香烃和饱和烃组分用适量正己烷完全溶解，旋转蒸发至适量后氮吹至1 mL装入样品瓶进行GCMS检测。三、
3、结果与讨论3.1降解菌的分离和形态从含油污泥样品中分离纯化得到3株石油烃降解菌，编号为RS1，RS2和RS3。通过扫描电镜观察RS1为椭圆形，RS2和RS3为短杆状。3.2菌株的16sRNA基因鉴定测定结果显示3株细菌的16sRNA基因序列长度分别为1422、1433和1415bp。将得到的基因序列与GenBank数据库中的序列进行比对，获得各序列的同源性信息（表1）。3.3菌株的最适降解条件最适降解温度 由图1可以看出，RS1在实验所选的温度范围内对石油均有超过10%的降解，其降解的最适温度范围为27 42，37时其对石油降解率最高;RS2降解的最适温度范围为32 37，32时RS2对石油降
4、解率最高;RS3在42时石油降解率最高，其降解的最适温度范围为32 42。最适降解盐度 由图2可以看出，RS1对盐度的适应性较好，在盐度为0.5%5%的环境下对石油烃具有25%以上的降解率;RS2和RS3的降解最适盐度范围均为0.5%3%。在5%的较高盐度条件下，只有RS1的降解率依然高于25%。最适降解pH pH对降解率的影响如图3所示，可以明显看出RS3在碱性环境下对石油烃的降解效果远远好于其他两株菌，其降解的最适pH范围可达610，RS1和RS2只适应中性环境，降解的最适pH范围均为68。3.4降解菌的降解特性降解菌对油泥中TPH的降解 相对于只添加营养的对照组，实验组油泥TPH均有明显
5、降低，RS1,RS2和RS3作用于油泥，TPH的降解率分别为39.69%,31.13%和53.29%，而混合菌的降解效果明显高于单一菌株，降解率为58.08%。3株菌对TPH的降解均在实验进行到20 d左右开始趋于缓慢。如图4所示。本实验结果也表明，混合菌的降解效果明显好于任何单一石油烃降解菌株。菌株对石油烃不同组分的降解如图5所示，3株石油烃降解菌均表现出对饱和烃有较好的降解，其中，RS1对饱和烃的降解率最高，达20.74%;而3株菌对芳香烃降解效果不如饱和烃，其中RS3对芳香烃的降解率最高，达到8.08%。混合菌对饱和烃和芳香烃的降解能力均高于任意单一菌株，降解率分别为24.65%和10.
6、77%。结果表明，降解菌对饱和烃的降解效果均明显好于芳香烃。3.4.3 PAHs的GCMS分析 混合菌对萘、苊、屈和苯并b荧蒽的降解能力较强,分别达到44.39%,27.79%,30.78%和39.43%，而对其他PAHs的降解效果则不明显。正构烷烃的GCMS分析对混合菌液处理7d的含油污泥中正构烷烃进行GCMS分析，与对照组相比，油泥样品中的正构烷烃n-C12n-C34均有明显降解。对其中n-C12n-C15、n-C27n-C34的降解效果较好。四、研究结论(1)从渤海油田含油污泥中分离出石油烃降解菌RS1,RS2和RS3，通过16S rRNA基因序列鉴定，分别为棒状杆菌属(Coryneba
7、cterium sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。(2)确定3株细菌对石油的最适降解条件分别为37、盐度3%,pH 8;32、盐度1%,pH 8;42、盐度1%,pH 6。其中RS 1对温度和盐度的适应性较好，RS3在碱性环境下对石油烃的降解效果远远好于其他2株细菌。(3)混合菌处理含油污泥30 d，对TPH的降解率可达58.08%，降解效果明显高于单一菌株。其中RS1对饱和烃的降解率最高，达20.74%，RS3对芳香烃的降解率最高，达到8.08%。(4)GCMS分析表明混合菌对n-C12n-C34 的正构烷烃均有明显降解，且对萘、苊、屈和苯并b荧蒽的降解能力较强，而对其他PAHs的降解效果则不明显。