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1、一章基因工程药物检验一章基因工程药物检验基因工程药物与一般药物比较：基因工程药物与一般药物比较：n n它它是是利利用用活活的的细细胞胞作作为为表表达达系系统统，所所获获得得蛋蛋白白质质产产品品往往往往相相对对分分子子质质量量较较大大，并并具具有有复杂的结构；复杂的结构；n n许许多多基基因因工工程程药药物物是是参参与与人人体体一一些些生生理理功功能能精精密密调调节节所所必必需需的的蛋蛋白白质质，极极微微量量就就可可产产生显著效应。生显著效应。n n宿宿主主细细胞胞中中表表达达的的外外源源基基因因，在在转转录录或或翻翻译、工艺放大等过程中，都有可能发生变化。译、工艺放大等过程中，都有可能发生变化
2、。一、基因工程药物质量要求一、基因工程药物质量要求n n(1)要要求求提提供供关关于于表表达达体体系系的的详详细细资资料料，以以及及工工程程菌菌(或或工工程程细细胞胞)的的特特征征、纯纯度度(是是否否污染外来因子污染外来因子)和遗传稳定性等资料。和遗传稳定性等资料。n n(2)提提供供培培养养方方法法和和产产量量稳稳定定性性、纯纯化化方方法法以以及及各各步步中中间间产产品品的的收收率率和和纯纯度度、除除去去微微量量的的外外来来抗抗原原、核核酸酸、病病毒毒或或微微生生物物等等方方法。法。n n(3)要要求求进进行行理理化化鉴鉴定定，包包括括产产品品的的特特征征、纯纯度度及及与与天天然然产产品品的
3、的一一致致性性。一一般般纯纯度度应在应在95%以上。以上。n n(4)要要求求进进行行外外源源核核酸酸和和抗抗原原检检测测，规规定定每每剂剂量量DNA含含量量不不超超过过l00pg，细细胞胞培培养养产产品品中中小小牛牛血血清清含含量量须须合合格格。成成品品中中不不应应含含有有纯纯化化过过程程中中使使用用的的试试剂剂，包包括括层层析柱试剂和亲和层析用的鼠析柱试剂和亲和层析用的鼠IgG。n n(5)生物活性或效力试验结果应与天然产品进行比较。n n(6)基因工程产品的理化和生物学性质与天然产品完全相同者一般不需重复所有动物毒性试验，与天然产品略有不同者需做较多试验，与天然产品有很大不同者则须做更多
4、试验，包括致癌、致畸和对生育力的影响等。n n(7)所有基因工程产品都必须经过临床试验，以评价其安全性和有效性。二、基因工程药物的质控要点二、基因工程药物的质控要点n n(一一)原材料的控制原材料的控制n n(二二)生产的控制生产的控制n n(三三)最终产品的质量控制最终产品的质量控制1、表达载体和宿主细胞、表达载体和宿主细胞 应提供有关表达载体详细资料，包括基因应提供有关表达载体详细资料，包括基因的来源、克隆和鉴定、表达载体的构建、的来源、克隆和鉴定、表达载体的构建、结构和遗传特性。结构和遗传特性。(一一)原材料的控制原材料的控制2、克隆基因的序列、克隆基因的序列 应提供插入基因和表达载体两
5、侧端应提供插入基因和表达载体两侧端控制区的核苷酸序列。所有与表达有控制区的核苷酸序列。所有与表达有关的序列均应详细叙述。关的序列均应详细叙述。3.表达表达 应详细叙述在生产过程中，启动应详细叙述在生产过程中，启动和控制克隆基因在宿主细胞中的表和控制克隆基因在宿主细胞中的表达所采用的方法及表达水平。达所采用的方法及表达水平。(二二)生产的控制生产的控制 在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；在重复生产发酵中，工程菌表达
6、稳定；始终能排除外源微生物污染。始终能排除外源微生物污染。1、原始细胞库 应详细记述种子材料的来源、方式、保存及预计使用寿命；应提供在保存和复苏条件下宿主载体表达系统的稳定性证据；采用新的种子批时，应重新作全面检定。2、有限代次的生产 提供培养生产浓度与产量恒定性的数据；依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数和细胞倍增数，并应提供最适培养条件的详细资料。n n 3、连续培养生产n n 应提供经长期培养后所表达基因的分子完整性资料，以及宿主细胞的表型和基因型特征。4 4、纯化、纯化、纯化、纯化 对于收获、分离和纯化的方法应详细记述，应对于收获、分离和纯化的方法应详细记述，应对于收获、
7、分离和纯化的方法应详细记述，应对于收获、分离和纯化的方法应详细记述，应特别注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物质的特别注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物质的特别注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物质的特别注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物质的去除。去除。去除。去除。对整个纯化工艺应进行全面研究，包括能够去对整个纯化工艺应进行全面研究，包括能够去对整个纯化工艺应进行全面研究，包括能够去对整个纯化工艺应进行全面研究，包括能够去除宿主细胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它杂质以除宿主细胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它杂质以除宿主细胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它杂质以除宿主细胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它杂质以及在纯化过
8、程中加入的有害的化学物质等。及在纯化过程中加入的有害的化学物质等。及在纯化过程中加入的有害的化学物质等。及在纯化过程中加入的有害的化学物质等。(三三)最终产品的质量控制最终产品的质量控制n n 应应建建立立有有关关产产品品的的鉴鉴别别、纯纯度度、稳定性和活性等方面的试验方法。稳定性和活性等方面的试验方法。(三)最终产品的质量控制1.产品的鉴定产品的鉴定电泳方法电泳方法免疫学分析方法免疫学分析方法受体结合试验受体结合试验高效液相色谱法高效液相色谱法肽图分析法肽图分析法Edman N末端序列分析法末端序列分析法圆二色谱法圆二色谱法核磁共振法核磁共振法n n (1)(1)氨基酸成分分析氨基酸成分分析
9、n n 氨氨基基酸酸成成分分分分析析可可为为目目的的产产物物的的纯纯度度检检定定提提供供信息。信息。n n n n 完完整整的的氨氨基基酸酸成成份份分分析析结结果果，应应包包括括甲甲硫硫氨氨酸酸、半半胱胱氨氨酸酸及及色色氨氨酸酸的的准准确确值值。氨氨基基酸酸成成份份分分析析结结果果应为三次分别水解样品测定后的平均值。应为三次分别水解样品测定后的平均值。n n (2)肽图分析肽图分析n n肽图分析（Peptide Mapping）：肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。
10、n n 肽图分析可作为与天然产品或参考品作精密比较的手段。与氨基酸成分和序列分析结果合并，可作为蛋白质的精确鉴别。(3)重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定 蛋白质浓度测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林-酚法和紫外光谱法等。蛋白质相对分子质量测定最常用的方法有凝胶过滤法和SDS-PAGE法。(4)蛋白质二硫键分析蛋白质二硫键分析 测定方法有测定方法有:对氯汞苯甲酸法等对氯汞苯甲酸法等 5，5-二硫基双二硫基双-2-硝基苯甲酸法硝基苯甲酸法2、纯度分析纯度分析n n(1)目的蛋白质含量测定目的蛋白质含量测定n n(2)产物杂质检测产物杂质检测(1)目的蛋白质含量测定目的蛋
11、白质含量测定 测定蛋白质含量的方法可根据目的蛋白质测定蛋白质含量的方法可根据目的蛋白质的理化性质和生物学特性来设计。的理化性质和生物学特性来设计。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳高效液相色谱高效液相色谱(2)产物杂质检测产物杂质检测 基因工程产物的杂质包括蛋白质和基因工程产物的杂质包括蛋白质和非蛋白质两类。非蛋白质两类。蛋白类杂质：蛋白类杂质：残留宿主细胞蛋白残留宿主细胞蛋白 采用免疫分析的方法采用免疫分析的方法非蛋白质类杂质：非蛋白质类杂质：病毒污染检查病毒污染检查无菌试验无菌试验热原质试验热原质试验残余细胞残余细胞DNA测定。测定。抗原性物质检查抗原性物质检查其他外源性物质其他外源性物
12、质常用检测方法：常用检测方法：常用检测方法：常用检测方法：杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物 检检检检 测测测测 方方方方 法法法法内毒素内毒素内毒素内毒素 鲎试剂、家兔鲎试剂、家兔鲎试剂、家兔鲎试剂、家兔热原法热原法热原法热原法宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白 免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、CECECECE其它蛋白杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质 免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、HPLC HPLC HPLC
13、 HPLC、CECECECE残余残余残余残余DNA DNADNA DNADNA DNADNA DNA杂交、紫外杂交、紫外杂交、紫外杂交、紫外光谱、蛋白结合光谱、蛋白结合光谱、蛋白结合光谱、蛋白结合蛋白变异蛋白变异蛋白变异蛋白变异 肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、HPLCHPLCHPLCHPLC、IEFIEFIEFIEF、CE CE CE CE 3.生物活性生物活性(效价效价)测定测定n n 生物活性测定是保证基因工程药物产品有效性的重要手段，往往需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。4.稳定性考察稳定性考察n n 药品的稳定性是评价药品有效性和安药品的稳定性是评价药品有效性和安全性的重要
14、指标之一，也是确定药品贮全性的重要指标之一，也是确定药品贮藏条件和使用期限的主要依据。藏条件和使用期限的主要依据。5、产品一致性的保证产品一致性的保证n n 只有对从原料、生产到产品的每一步只有对从原料、生产到产品的每一步骤都进行严格的控制和质量检定，才能骤都进行严格的控制和质量检定，才能确保各批最终产品都是安全有效、含量确保各批最终产品都是安全有效、含量和杂质限度一致并符合标准。和杂质限度一致并符合标准。第三节第三节 基因工程药物的检验基因工程药物的检验一、基因工程药物常用几种检验方法一、基因工程药物常用几种检验方法n n(一一)化学检定法化学检定法n n1.Lowry法则定蛋白质含量法则定
15、蛋白质含量n n2.用电泳法用电泳法(非还原型非还原型SDS-PAGE法法)测定测定纯度纯度n n3.用高效液相色谱用高效液相色谱(HPLC)法测定纯度法测定纯度n n4.用电泳法用电泳法(还原型还原型SDS-PAGE法法)测定相测定相对分子质量对分子质量n n5.用等电聚焦电泳法测等电点用等电聚焦电泳法测等电点(二二)肽图分析法肽图分析法n n肽图分析（肽图分析（肽图分析（肽图分析（Peptide MappingPeptide Mapping）：肽图分析是根据蛋）：肽图分析是根据蛋）：肽图分析是根据蛋）：肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使白质、多肽的分子量大小以及氨
16、基酸组成特点，使白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶（一般为肽链内切酶）用专一性较强的蛋白水解酶（一般为肽链内切酶）用专一性较强的蛋白水解酶（一般为肽链内切酶）用专一性较强的蛋白水解酶（一般为肽链内切酶）作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。一定的分离检测手段形成特征性指
17、纹图谱。n n 肽图谱分析是基因工程多肽药物质量控制的重要手肽图谱分析是基因工程多肽药物质量控制的重要手肽图谱分析是基因工程多肽药物质量控制的重要手肽图谱分析是基因工程多肽药物质量控制的重要手段。肽图谱对每一种蛋白质来说是特征的、专一的。段。肽图谱对每一种蛋白质来说是特征的、专一的。段。肽图谱对每一种蛋白质来说是特征的、专一的。段。肽图谱对每一种蛋白质来说是特征的、专一的。通过肽图分析可以鉴别蛋白质，预测其一级结构特通过肽图分析可以鉴别蛋白质，预测其一级结构特通过肽图分析可以鉴别蛋白质，预测其一级结构特通过肽图分析可以鉴别蛋白质，预测其一级结构特征。征。征。征。(三三)外源性外源性DNA残留量
18、的测定残留量的测定n n 检测残留DNA的方法可采用杂交分析技术、顺序单独分析技术或其他灵敏的分析技术。(四四)宿主细胞蛋白杂质的检测宿主细胞蛋白杂质的检测n n 宿主蛋白是基因工程药物特有的杂质，其含量是质量控制的一项重要指标。目前采用点-免疫结合法测定。(五五)无菌试验无菌试验 基基因因工工程程药药物物和和其其他他生生物物制制品品不不得得含含有有杂杂菌菌，灭灭活活疫疫苗苗不不得得含含有有活活的的本本菌菌、本本毒毒。在在制制造造过过程程中中应应由由制制造造部部门门按按各各制制品品制制造造及及检检定定规规程程规规定定进进行行无无菌菌试试验验，分分装装后后的的制制品品须经质量检定部门做最后检定。
19、须经质量检定部门做最后检定。(六六)内毒素试验内毒素试验 基因工程药物内毒素的检定按照基因工程药物内毒素的检定按照中国生物制品规程中国生物制品规程2000年版年版的规定进行。的规定进行。n n(七七)异常毒性试验异常毒性试验n n异常毒性试验是指各制品的特异性异常毒性试验是指各制品的特异性毒性试验以外的一般安全试验。目毒性试验以外的一般安全试验。目的是通过动物试验检查制品中外源的是通过动物试验检查制品中外源性毒性物质的污染情况以及是否存性毒性物质的污染情况以及是否存在意外的不安全因素，以保证人体在意外的不安全因素，以保证人体使用安全。使用安全。n(八八)热原质试验热原质试验n n基因工程药物热原质的检定按照基因工程药物热原质的检定按照中国生物制品规程中国生物制品规程2000年版的年版的规定进行。规定进行。n(九九)生物学活性生物学活性(效价效价)检定检定 n n 各各种种基基因因工工程程药药物物活活性性(效效价价)的的检检定定按按照照中中国国生生物物制制品品规规程程2000年年版版的的规定进行。规定进行。