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1、关于生化药物与基因工程药物分析第1页，此课件共50页哦 第一节第一节 概概 述述 第2页，此课件共50页哦 第一节第一节 概概 述述 第一代生物药物：生物体某些第一代生物药物：生物体某些天然活性物质加工天然活性物质加工制成，制成，例如胎盘制剂例如胎盘制剂第二代：利用生化技术从生物材料中第二代：利用生化技术从生物材料中分离、纯化分离、纯化获获得的，例如纯化胰岛素得的，例如纯化胰岛素第三代：利用生物技术生产的天然生化物质及经过第三代：利用生物技术生产的天然生化物质及经过生物工程手段改造的新物质生物工程手段改造的新物质第3页，此课件共50页哦一、生物药物的概念一、生物药物的概念利用利用生物体、生物组
2、织或器官等成分生物体、生物组织或器官等成分，综合，综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制的的学、物理化学和药学的原理与方法制的的一类药物一类药物广义：从动物、植物、微生物等生物体中广义：从动物、植物、微生物等生物体中制取的各种天然生物活性物质以及人工合制取的各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物成或半合成的天然物质类似物第4页，此课件共50页哦（一）生化药物：利用生物化学的理论、方法和技术，从动物、植物以利用生物化学的理论、方法和技术，从动物、植物以及微生物等生物体中提取分离的天然活性物质，以及及微生物等生
3、物体中提取分离的天然活性物质，以及这些物质及其衍生物的化学合成、半合成和现代生物这些物质及其衍生物的化学合成、半合成和现代生物技术制的的产品。技术制的的产品。例例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。第5页，此课件共50页哦（二）生物技术药物生物技术：生物技术：利用生物体或其组成部分发展产品的利用生物体或其组成部分发展产品的技术体系，生物技术作为一种手段可用以研究和技术体系，生物技术作为一种手段可用以研究和开发新药。开发新药。生物技术药物（生物工程药物）：生物技术药物（生物工程药物）：用生物技术用生物技术研制的药物研制的药物第6页，此课件共50页哦（三）基因工程药物先确定
4、对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制蛋白质合成过程的基因分离、纯化或进行人后将控制蛋白质合成过程的基因分离、纯化或进行人工合成，利用重组工合成，利用重组DNADNA技术加以改造，最后将该基技术加以改造，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖或表达，因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖或表达，并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质白质第7页，此课件共50页哦（四）生物制品应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生
5、物技术获得的微生物、细胞及各种动物发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物或人源组织和体液等生物材料制备，用于人类疾病的或人源组织和体液等生物材料制备，用于人类疾病的预防、治疗和诊断的药品。预防、治疗和诊断的药品。第8页，此课件共50页哦生物制品的分类预防：菌苗（卡介苗）、疫苗（乙肝疫苗）、类毒素预防：菌苗（卡介苗）、疫苗（乙肝疫苗）、类毒素（破伤风类毒素）（破伤风类毒素）治疗：特异性治疗用品（狂犬病免疫球蛋白）、治疗：特异性治疗用品（狂犬病免疫球蛋白）、非特异性治疗用品（白蛋白）非特异性治疗用品（白蛋白）诊断：免疫诊断用品（结核菌素）诊断：免疫诊断用品（结核菌素）第9页，此课件共50页
6、哦 1.1.生物体的基本生化成分生物体的基本生化成分 来自生物体，参与、调控和影响人体代谢和生理功来自生物体，参与、调控和影响人体代谢和生理功能，在某些疾病治疗时具有针对性强、毒副作用小的特能，在某些疾病治疗时具有针对性强、毒副作用小的特点。部分蛋白质药物，极微量就可产生显著效果。点。部分蛋白质药物，极微量就可产生显著效果。2.2.分子量大分子量大:分子量一般为几千至几十万，结构复杂，甚至不确分子量一般为几千至几十万，结构复杂，甚至不确定，分析和检验困难，常需纯度分析和分子量测定。定，分析和检验困难，常需纯度分析和分子量测定。二、药物治疗控制的特点二、药物治疗控制的特点第10页，此课件共50页
7、哦 3.3.结构难确证：各种技术结构难确证：各种技术 4.4.全过程的质量控制：全过程的质量控制：对酸、碱、热、对酸、碱、热、pHpH等敏感，严格控制实验条件和鉴等敏感，严格控制实验条件和鉴定质量。基因工程药物比传统工艺生产的药物要求更高。定质量。基因工程药物比传统工艺生产的药物要求更高。5.5.生物活性检查生物活性检查多肽、蛋白质类药物，除采用理化检验外，还需采用生多肽、蛋白质类药物，除采用理化检验外，还需采用生物鉴定法证实其生物活性。物鉴定法证实其生物活性。二、药物治疗控制的特点二、药物治疗控制的特点第11页，此课件共50页哦 6.6.安全性检查安全性检查 热源检查、过敏实验、致突变实验热
8、源检查、过敏实验、致突变实验 7.7.效价（含量）测定：效价（含量）测定：理化法理化法：生物药物和基因工程药物：生物药物和基因工程药物 效价测定和活性测定效价测定和活性测定：酶类药物：酶类药物 二、药物治疗控制的特点二、药物治疗控制的特点第12页，此课件共50页哦第二节 质量控制的项目和方法来源和种类来源和种类性状性状鉴别鉴别检查检查含量测定含量测定第13页，此课件共50页哦 一、鉴别试验一、鉴别试验 理化鉴别法：化学鉴别法理化鉴别法：化学鉴别法 紫外分光光度法紫外分光光度法 HPLCHPLC法法生化鉴别法：酶法生化鉴别法：酶法 电泳法电泳法 样品脱盐后等电点聚焦法测定样品脱盐后等电点聚焦法测
9、定生物鉴别法：血清学法生物鉴别法：血清学法 生物学法生物学法第14页，此课件共50页哦（一）（一）理化鉴别法理化鉴别法 1.1.化学鉴别法化学鉴别法：例：溶菌酶例：溶菌酶 +Cu+Cu2+2+络合显色络合显色第15页，此课件共50页哦 2.2.紫外分光光度法紫外分光光度法 最大吸收波长固定不变，紫外光谱图一致最大吸收波长固定不变，紫外光谱图一致 溶剂：溶剂：0.01mol/L0.01mol/L盐酸盐酸例：三磷酸腺苷二钠例：三磷酸腺苷二钠 浓度：浓度：20g/ml20g/ml 判断：判断：maxmax：2571nm2571nm 3.3.HPLCHPLC法：法：利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保
10、留利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。时间和肽图谱的一致性进行鉴别。第16页，此课件共50页哦 （二）生化鉴别法（二）生化鉴别法1.1.酶法酶法：例：尿激酶的鉴别例：尿激酶的鉴别-气泡上升法气泡上升法 原理：原理：第17页，此课件共50页哦 方法方法：取取小小试试管管，加加入入尿尿激激酶酶巴巴比比妥妥溶溶液液、牛牛纤纤维维蛋蛋白白原原溶溶液液，再再依依次次加加入入牛牛纤纤维维蛋蛋白白溶溶酶酶原原溶溶液液、牛牛凝凝血血酶酶溶溶液液，迅迅速速摇摇匀匀，立立即即置置370.5370.5恒恒温温水水浴浴保保温温，记记时时。反反应应系系统统在在30304040秒秒内内凝凝
11、结结，凝凝结结块块内内有有气气泡泡生生成成，1515分分钟钟内内凝凝结结块块溶溶解解，当当凝凝结结块块溶溶解解时时，气气泡泡逐逐渐渐上上升升。以以0.9%0.9%氯氯化化钠钠作作空空白白，同法同法 操作，凝结块在操作，凝结块在2 2小时内不溶。小时内不溶。第18页，此课件共50页哦2.2.电泳法电泳法：带电荷的供试品在惰性支持介质中，与电场带电荷的供试品在惰性支持介质中，与电场的作用下，按各自的速度向其对应的电极方的作用下，按各自的速度向其对应的电极方向泳动，使组分分离成狭窄的区带。向泳动，使组分分离成狭窄的区带。第19页，此课件共50页哦2.2.电泳法电泳法：以肝素鉴别为例。：以肝素鉴别为例
12、。与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。第20页，此课件共50页哦3.样品脱盐后等电点聚焦法测定样品脱盐后等电点聚焦法测定基因工程药物等电点不一致基因工程药物等电点不一致同一产品，不管有几个等电点，批与批之间必同一产品，不管有几个等电点，批与批之间必须一致须一致第21页，此课件共50页哦（三）生物鉴别法1.1.血清学法血清学法体外的抗原抗体试验。体外的抗原抗体试验。经典血清学反应：经典血清学反应：凝集反应、沉淀反应、中和反应和补给结合反应凝集反应、沉淀反应、中和反应和补给结合反应免疫扩散、免疫电泳以及荧光标记、酶标记等免疫扩散、免疫电泳以及荧光标记、酶标记
13、等高敏感的检测技术高敏感的检测技术第22页，此课件共50页哦 2.2.生物法生物法：利用生物体进行试验来鉴别药物。利用生物体进行试验来鉴别药物。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50%GS50%GS，惊厥停止。，惊厥停止。第23页，此课件共50页哦 一般杂质检查：氯化物、硫酸盐、铵盐、一般杂质检查：氯化物、硫酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度等铁盐、重金属、酸度等特殊杂质检查：原料药纯度分析和生产过程特殊杂质检查：原料药纯度分析和生产过程中杂质的检查
14、中杂质的检查二 杂质检查第24页，此课件共50页哦（二）特殊杂质检查1.1.原料药的纯度分析原料药的纯度分析多糖类纯度分析：低聚糖及可能混入的核酸、蛋多糖类纯度分析：低聚糖及可能混入的核酸、蛋白质白质2.2.生成过程中杂质的检查生成过程中杂质的检查有传统生产方法不可能存在的有害杂质，如内毒素、致有传统生产方法不可能存在的有害杂质，如内毒素、致敏原敏原第25页，此课件共50页哦生化药物和基因药物的含量表示方法：生化药物和基因药物的含量表示方法：百分含量百分含量：适用于结构明确的小分子药：适用于结构明确的小分子药 物或经水解后变成小分子的物或经水解后变成小分子的 药物。药物。生物效价或酶活力单位生
15、物效价或酶活力单位：适用于酶类、：适用于酶类、蛋白质类药物。蛋白质类药物。三、含量（效价）测定三、含量（效价）测定第26页，此课件共50页哦第三节第三节 定量分析方法定量分析方法理化分析法理化分析法生化测定法生化测定法生物检定法生物检定法第27页，此课件共50页哦一、理化分析法（一）化学分析法（一）化学分析法重量法：重量法：根据样品中分离出的单质或化合物的重量测根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的含量。定所含成分的含量。滴定分析法：滴定分析法：根据生物制品中某些成分能与标准根据生物制品中某些成分能与标准溶液定量的发生酸碱中和反应、氧化还原反应等溶液定量的发生酸碱中和反应、氧化还原
16、反应等特性，通过滴定过程而进行生物制品的含量测定特性，通过滴定过程而进行生物制品的含量测定的方法的方法第28页，此课件共50页哦（二）电化学分析法电化学分析法：建立在物质在溶液中的电化学性质电化学分析法：建立在物质在溶液中的电化学性质基础上的一类仪器分析方法，通常将试液作为化学基础上的一类仪器分析方法，通常将试液作为化学电池的一个组成部分，根据该电池的某种电参数电池的一个组成部分，根据该电池的某种电参数（如电阻、（如电阻、电导电导、电位电位、电流电流、电量或电流、电量或电流-电压电压曲线等）与被测物质的浓度之间存在一定的关曲线等）与被测物质的浓度之间存在一定的关系而进行测定的方法。系而进行测定
17、的方法。第29页，此课件共50页哦（三）光谱法1.1.比色法比色法供试品中某些成分可与显色剂发生颜色反应，根供试品中某些成分可与显色剂发生颜色反应，根据颜色的深浅，与标准液进行同法处理后比较，据颜色的深浅，与标准液进行同法处理后比较，即可测定含量。即可测定含量。例：蛋白质与双缩脲试剂发生颜色反应例：蛋白质与双缩脲试剂发生颜色反应第30页，此课件共50页哦（三）光谱法2.2.紫外分光光度法：生物制品或相关的反应产物的紫外紫外分光光度法：生物制品或相关的反应产物的紫外光谱在某一特征波长处有最大吸收，且一定的浓度范光谱在某一特征波长处有最大吸收，且一定的浓度范围内与相应的吸光度成正比，则可用于生物制
18、品的含围内与相应的吸光度成正比，则可用于生物制品的含量测定量测定第31页，此课件共50页哦（三）光谱法3.3.荧光分光光度法：荧光分光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。可以从发射光谱或激发光谱进行分析。该法灵敏度高(通常比紫外分光光度法高23个数量级)，选择性好。第32页，此课件共50页哦（四）高效液相色谱法具有高效分析、灵敏检测、操作简便的优点具有高效分析、灵敏检测、操作简便的优点分离过程中不破坏分离样品的特点分离过程中不破坏分离样品的特点适合于对高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的适合于对高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的生物制品
19、的定量分析生物制品的定量分析第33页，此课件共50页哦二、生化分析法（一）酶法以酶为分析对象的分析：酶活力测定法以酶为分析对象的分析：酶活力测定法目的是测酶的活性或活力目的是测酶的活性或活力以酶为分析工具或分析试剂的分析方法：酶分析法以酶为分析工具或分析试剂的分析方法：酶分析法主要测定样品中酶以外其他物质的含量主要测定样品中酶以外其他物质的含量第34页，此课件共50页哦1 1）基本概念：）基本概念：酶活力酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活
20、力越高。度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。酶反酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。来表示。1.酶活力测定法第35页，此课件共50页哦1 1）基本概念：）基本概念：酶单位酶单位：任何一种酶，在：任何一种酶，在2525以最适当的底物浓度、以最适当的底物浓度、最适当的缓冲液离子强度以及最适当的最适当的缓冲液离子强度以及最适当的pHpH等条件下，等条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位（国际单位，位（国际单位，IUIU）1.酶活力测定法第36页，此课件共50页哦1 1
21、）基本概念：）基本概念：酶的比活性酶的比活性：为每毫克蛋白质所具有的酶单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。1.酶活力测定法第37页，此课件共50页哦酶反应进程曲线酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化量，横纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。应进程曲线求得反应的初速度。酶浓度曲线酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。第38页，此课件共50页哦2 2）酶促反应的）
22、酶促反应的条件条件及及影响因素影响因素 底物的浓度底物的浓度：一般选用底物的浓度：一般选用底物的浓度S=100KS=100Km m。pHpH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、适宜的适宜的pHpH值的缓冲系统来控制值的缓冲系统来控制pHpH。温度温度：酶反应的温度通常选用：酶反应的温度通常选用2525、3030或或 3737，实验中温度变动应控制在，实验中温度变动应控制在0.10.1以内。以内。辅助因子辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。相应的辅酶。第39页，此课件共50页哦3 3）测定方法：）测定方法：取样测定
23、法、连续测定法取样测定法、连续测定法取样测定法：在酶反应开始后不同的时间，从反应系取样测定法：在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法停止其反统中取出一定量的反应液，并用适当的方法停止其反应后，再根据底物和产物在化学性质上的差异，用适应后，再根据底物和产物在化学性质上的差异，用适当的检测方法进行定量分析，求得单位时间内酶促反当的检测方法进行定量分析，求得单位时间内酶促反应变化量的方法。应变化量的方法。连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连续监测的方法。续监测的方法。第40页，此课件共50页哦4 4）酶活力测定的方
24、法）酶活力测定的方法检测方法：检测方法：紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法 旋光法旋光法荧光分光光度法荧光分光光度法 电化学测定法电化学测定法 酶偶联测定法酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。离子选择性电极测定法等。第41页，此课件共50页哦2.2.酶分析法酶分析法 分析对象是酶的底物、辅酶活分析对象是酶的底物、辅酶活化剂、酶的抑制剂。化剂、酶的抑制剂。1.1.动力学分析法动力学分析法 2.2.总变量分析法本法又称为平衡法总变量分析法本法又称为平衡法或终点法。或终点法。仅适用于底物的测定。仅适用于底物的测定。第42页，此课件共50页哦（二）电泳法（二）电泳法 电泳法可分为三大类：自由界面
25、电泳法可分为三大类：自由界面电泳、区带电泳、高效毛细管电泳电泳、区带电泳、高效毛细管电泳（HPCE)HPCE)。根据所用支持物的不同分为：纸电泳根据所用支持物的不同分为：纸电泳法、醋酸纤维素薄膜电泳法、法、醋酸纤维素薄膜电泳法、PAGEPAGE法、法、SDS-PAGESDS-PAGE法、琼脂糖凝胶电泳法法、琼脂糖凝胶电泳法第43页，此课件共50页哦1 1、自由界面电泳：、自由界面电泳：在一根在一根U U形管里的溶液中，同种分子的构型形管里的溶液中，同种分子的构型及荷电情况基本一致，在电场影响下，它们及荷电情况基本一致，在电场影响下，它们逐渐密集而与其他电泳迁移率不同的物质之逐渐密集而与其他电泳
26、迁移率不同的物质之间形成明显的界面。间形成明显的界面。第44页，此课件共50页哦2 2、区区带带电电泳泳：在在电电泳泳过过程程中中，应应用用各各种种不不同同的的惰惰性性支支持持介介质质，在在电电场场作作用用下下，使使具具有有不不同同泳泳动动速速度度的的组组分分形形成成各各自自区区带带的的电电泳泳。常常用用的的支支持持物物有有：滤滤纸纸、醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜、聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶（PAGEPAGE）、十十二二烷烷基基硫硫酸酸纳纳-聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE SDS-PAGE）。）。第45页，此课件共50页哦3、高效毛细管电泳法（、高效毛细管电泳法（HPCEH
27、PCE）在在一一根根内内径径约约50um50um的的毛毛细细管管中中，在在高高压压电电场场下下进进行行样样品品分分离离分分析析的的一一种种新新型型电电泳泳技技术。术。第46页，此课件共50页哦三、生物检定法三、生物检定法 生生物物检检定定法法是是利利用用药药物物对对生生物物体体（整整体体动动物物、离离体体组组织织、微微生生物物等等）的的作作用用以以测测定其效价或生物活性的一种方法。定其效价或生物活性的一种方法。第47页，此课件共50页哦1 1、生物药物含量的测定、生物药物含量的测定测测定定对对一一些些采采用用理理化化方方法法不不能能测测定定含含量量或或理理化化测测定定不不能能反反映映临临床床生
28、生物物活活性性的的药药物物可可用用生生物物检检定定法法来来控控制制药药物物质质量量。如如洋地黄、胰岛素、肝素及各种抗生素。洋地黄、胰岛素、肝素及各种抗生素。第48页，此课件共50页哦2 2、大分子结构的测定、大分子结构的测定 某某些些生生物物制制品品因因结结构构复复杂杂、分分子子量量大大，而而且且由由结结构构类类似似、比比例例不不定定的的多多种种成成分分组组成成，很很难难用用理理化化方方法法反反映映其其生生物物活活性性；某某些些药药物物虽虽可可用用理理化化方方法法测测定定含含量量，但但不不能能完全反映效价。以上药物均采用生物检定。完全反映效价。以上药物均采用生物检定。第49页，此课件共50页哦感谢大家观看第50页，此课件共50页哦