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1、实验实验 细菌的染色细菌的染色细菌的单染色法细菌的单染色法细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色芽孢染色芽孢染色荚膜的染色荚膜的染色1 1 1 1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法的简单染色法的简单染色法的简单染色法。2 2 2 2、初步认识细菌的形态特征。、初步认识细菌的形态特征。、初步认识细菌的形态特征。、初步认识细菌的形态特征。3 3 3 3、学习细菌的革兰氏染色原理和方法学习细菌的革兰氏染色原理和方法4 4、了解细菌的特殊形态结构：、了解细菌的特殊形态结
2、构：芽孢、荚膜、鞭毛的染色芽孢、荚膜、鞭毛的染色5 5 5 5、学习训练无菌操作技术。、学习训练无菌操作技术。、学习训练无菌操作技术。、学习训练无菌操作技术。实验目的实验目的 简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。观察。观察。观察。常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、常用碱性染料
3、进行简单染色，因为在中性、常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景结合使细
4、菌着色，经染色后的细菌细胞与背景结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。实验原理实验原理1 1 1 1 细菌的简单染色细菌的简单染色细菌的简单染色细菌的简单染色 常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。性复红等。性复红等。性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基当细菌分解糖类产酸使
5、培养基当细菌分解糖类产酸使培养基当细菌分解糖类产酸使培养基pHpHpHpH下降时，细菌下降时，细菌下降时，细菌下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。等酸性染料染色。等酸性染料染色。等酸性染料染色。实验原理实验原理(continued)细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。利用单一染料对细菌进行染
6、色，使经染色后的菌利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。到其形态和结构。到其形态和结构。到其形态和结构。1 1 1 1、菌种、菌种、菌种、菌种枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌1212121218181818h h h h培养物培养物培养物培养物金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌242424
7、24h h h h培养物培养物培养物培养物2 2 2 2、染色剂、染色剂、染色剂、染色剂吕氏吕氏吕氏吕氏碱性美蓝染液碱性美蓝染液碱性美蓝染液碱性美蓝染液齐氏石碳酸复红染液齐氏石碳酸复红染液齐氏石碳酸复红染液齐氏石碳酸复红染液实验材料实验材料 涂片涂片干燥干燥 固定固定染色染色水洗水洗干燥干燥镜检镜检操作步骤操作步骤 四、实验步骤四、实验步骤无菌操作无菌操作无菌操作无菌操作菌悬液菌悬液菌悬液菌悬液涂片涂片涂片涂片干燥干燥干燥干燥滴加无滴加无滴加无滴加无菌水菌水菌水菌水固定固定固定固定取菌苔取菌苔取菌苔取菌苔涂片涂片涂片涂片操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤（continuedcontinuedco
8、ntinuedcontinued）1 1、涂片涂片 取取取取两块载玻两块载玻两块载玻两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环沾取）片，各滴一小滴（或用接种环沾取）片，各滴一小滴（或用接种环沾取）片，各滴一小滴（或用接种环沾取）生理盐水（或无菌水）于玻片中央，用接种环以无生理盐水（或无菌水）于玻片中央，用接种环以无生理盐水（或无菌水）于玻片中央，用接种环以无生理盐水（或无菌水）于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从枯草杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑菌操作分别从枯草杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑菌操作分别从枯草杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑菌操作分别从枯草杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混合并涂
9、成薄膜。取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-1-1-1-2 2 2 2环直接涂于载玻片上。环直接涂于载玻片上。环直接涂于载玻片上。环直接涂于载玻片上。Notes:1Notes:1Notes:1Notes:1）载玻片要洁净无油迹载玻片要洁净无油迹载玻片要洁净无油迹载玻片要洁净无油迹 2 2 2 2）滴生理盐水）滴生理盐水）滴生理盐水）滴生理盐水和取菌不宜过多和取菌不宜过多
10、和取菌不宜过多和取菌不宜过多 3 3 3 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。操作步骤（操作步骤（操作步骤（操作步骤（continuedcontinuedcontinuedcontinued）3 3 3 3、固定、固定、固定、固定固定的目的：固定的目的：固定的目的：固定的目的：1 1 1 1）使细胞质凝固，以固定细胞形态；）使细胞质凝固，以固定细胞形态；）使细胞质凝固，以固定细胞形态；）使细胞质凝固，以固定细胞形态；2 2 2 2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。）并使菌体牢固地附着在载玻片上。）并使菌体牢固地附着在载
11、玻片上。）并使菌体牢固地附着在载玻片上。固定方法：固定方法：固定方法：固定方法：热固定：涂面朝上，通过火焰数次热固定：涂面朝上，通过火焰数次热固定：涂面朝上，通过火焰数次热固定：涂面朝上，通过火焰数次注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜，注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜，注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜，注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态否则会改变甚至破坏细胞形态否则会改变甚至破坏细胞形态否则会改变甚至破坏细胞形态操作步骤（操作步骤（操作步骤（操作步骤（continuedcontinuedcontinuedcontinued）2 2 2 2
12、、干燥、干燥、干燥、干燥 室温自然干燥室温自然干燥室温自然干燥室温自然干燥4 4 4 4、染色、染色、染色、染色 将将将将玻片平放于玻片搁架玻片平放于玻片搁架玻片平放于玻片搁架玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上上，滴加染液于涂片上上，滴加染液于涂片上上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。美蓝染色美蓝染色美蓝染色美蓝染色1-21-21-21-2minminminmin；石碳酸复红染色约石碳酸复红染色约石碳酸复红染色约石碳酸复红染色约1 1 1 1minminminmin。操作步骤操作步骤操作
13、步骤操作步骤（continuedcontinuedcontinuedcontinued）5 5 5 5、水洗、水洗、水洗、水洗倒去倒去倒去倒去染液，用洗瓶（内装自来水）轻轻冲洗，直至涂染液，用洗瓶（内装自来水）轻轻冲洗，直至涂染液，用洗瓶（内装自来水）轻轻冲洗，直至涂染液，用洗瓶（内装自来水）轻轻冲洗，直至涂片上流下来的水无色为止；染色废液收集在废液缸中。片上流下来的水无色为止；染色废液收集在废液缸中。片上流下来的水无色为止；染色废液收集在废液缸中。片上流下来的水无色为止；染色废液收集在废液缸中。Note:Note:Note:Note:水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载水洗时，不要直接冲洗
14、涂面，而应使水从载水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。7 7 7 7、镜检、镜检、镜检、镜检 细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。操作步骤（操作步骤（操作步骤（操作步骤（continuedcontinuedcontinuedco
15、ntinued）6 6 6 6、干燥、干燥、干燥、干燥自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。7 7 7 7、镜检（、镜检（、镜检（、镜检（continuedcontinuedcontinuedcontinued）Notes:Notes:Notes:Notes:1)1)必须等涂片完全干后才可滴加香柏油必须等涂片完全干后才可滴加香柏油必须等涂片完全干后才可滴加香柏油必须等涂片完全干后才可滴加香柏油2)2)油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净，油镜使用完毕，切记按规定步骤擦
16、干净，油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净，油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净，否则可能损害镜头否则可能损害镜头否则可能损害镜头否则可能损害镜头3 3 3 3）擦油镜镜头方法：分三步）擦油镜镜头方法：分三步）擦油镜镜头方法：分三步）擦油镜镜头方法：分三步 A A A A）先用擦镜纸揩去先用擦镜纸揩去先用擦镜纸揩去先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油镜头上的香柏油镜头上的香柏油镜头上的香柏油 B B B B）从双层瓶的下层沾少许二从双层瓶的下层沾少许二从双层瓶的下层沾少许二从双层瓶的下层沾少许二甲苯滴在另一片擦镜纸上甲苯滴在另一片擦镜纸上甲苯滴在另一片擦镜纸上甲苯滴在另一片擦镜纸上 ，擦拭镜头；，擦拭镜头
17、；，擦拭镜头；，擦拭镜头；C C C C）再用再用再用再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。操作步骤操作步骤（continued）2、革兰氏染色、革兰氏染色单染色法：只能观察微生物的大小、形状、单染色法：只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。它的特殊构造等。复染色法：用两种或两种以上染色液进行复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称染色，有协助鉴别微生物的作用，
18、故也称鉴别染色法。常用的有：鉴别染色法。常用的有：革兰氏染色法革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、荚膜染色法等。荚膜染色法等。细菌细胞壁的结构细菌细胞壁的结构G G G G肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，故用乙醇等有机溶剂脱色时溶解了类脂质，增故用乙醇等有机溶剂脱色时溶解了类脂质，增故用乙醇等有机溶剂脱色时溶解了类脂质，增故用乙醇等有机溶剂脱色时溶解了类脂质，增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘的复加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘的复加了细胞的通透性，
19、使初染的结晶紫和碘的复加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。G G G G细胞壁结构致密，用乙醇脱色处理后，肽细胞壁结构致密，用乙醇脱色处理后，肽细胞壁结构致密，用乙醇脱色处理后，肽细胞壁结构致密，用乙醇脱色处理后，肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。初染时的紫色。初染时的紫色。初染时的紫色。革兰氏染色的实验原理革兰氏染色的实验
20、原理细菌的特殊形态结构细菌的特殊形态结构芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各种极端环境。种极端环境。荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体鞭毛：运动，菌落形态。鞭毛：运动，菌落形态。实验材料实验材料大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（杆菌（2424h h培养物）、培养物）、胶质芽胞杆菌胶质芽胞杆菌革兰氏染色液一套革兰氏染色液一套实验步骤实验步骤革兰氏染色革兰氏染色枯草杆菌的芽孢染色枯草杆菌的芽孢染色荚膜的染色荚膜的染色绘图、写实验报告绘图、写实验报告革兰氏染色的革兰氏染色的步骤步骤1.1
21、.1.1.涂片涂片涂片涂片2.2.2.2.初染初染初染初染：在做好的涂面上滴加草：在做好的涂面上滴加草：在做好的涂面上滴加草：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染酸铵结晶紫染液，染酸铵结晶紫染液，染酸铵结晶紫染液，染1 1 1 1分钟，倾分钟，倾分钟，倾分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。去染液，流水冲洗至无紫色。去染液，流水冲洗至无紫色。去染液，流水冲洗至无紫色。3.3.3.3.媒染媒染媒染媒染：先用新配的路哥氏碘液：先用新配的路哥氏碘液：先用新配的路哥氏碘液：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面冲去残水，而后用其覆盖涂面冲去残水，而后用其覆盖涂面冲去残水，而后用其覆盖涂面1 1
22、1 1分钟，后水洗。分钟，后水洗。分钟，后水洗。分钟，后水洗。4.4.4.4.脱色脱色脱色脱色：除去残水后，滴加：除去残水后，滴加：除去残水后，滴加：除去残水后，滴加95%95%95%95%酒酒酒酒精进行脱色约精进行脱色约精进行脱色约精进行脱色约1515151520202020秒，后立即秒，后立即秒，后立即秒，后立即用流水冲洗。用流水冲洗。用流水冲洗。用流水冲洗。5.5.5.5.复染复染复染复染：滴加番红染色液，染：滴加番红染色液，染：滴加番红染色液，染：滴加番红染色液，染3 3 3 35 5 5 5分钟，水洗后用吸水纸吸干。分钟，水洗后用吸水纸吸干。分钟，水洗后用吸水纸吸干。分钟，水洗后用吸
23、水纸吸干。6.6.6.6.镜检镜检镜检镜检：观察染色结果并绘图。：观察染色结果并绘图。：观察染色结果并绘图。：观察染色结果并绘图。Figure 1-A Gram Figure 1-A Gram stain of Gram+stain of Gram+StaphylococcusStaphylococcus cells.cells.Figure 2-Gram Figure 2-Gram stain of Gram stain of Gram E.E.colicoli cells cells3 枯草杆菌芽孢的染色枯草杆菌芽孢的染色1 1 1 1、制备菌液：加、制备菌液：加、制备菌液：加、制备菌液：
24、加2-42-42-42-4滴蒸馏水于小试管中，用接滴蒸馏水于小试管中，用接滴蒸馏水于小试管中，用接滴蒸馏水于小试管中，用接种环从斜面挑取菌体种环从斜面挑取菌体种环从斜面挑取菌体种环从斜面挑取菌体2 2 2 2环于试管中充分混匀。环于试管中充分混匀。环于试管中充分混匀。环于试管中充分混匀。2 2 2 2、加染色液：加孔雀绿、加染色液：加孔雀绿、加染色液：加孔雀绿、加染色液：加孔雀绿3 3 3 3滴于小试管中。滴于小试管中。滴于小试管中。滴于小试管中。3 3 3 3、加热：沸水浴，、加热：沸水浴，、加热：沸水浴，、加热：沸水浴，15-2015-2015-2015-20分钟。分钟。分钟。分钟。4 4
25、 4 4、涂片：用接种环从小试管中取一环菌涂于一、涂片：用接种环从小试管中取一环菌涂于一、涂片：用接种环从小试管中取一环菌涂于一、涂片：用接种环从小试管中取一环菌涂于一干净载玻片上，制成涂片。干净载玻片上，制成涂片。干净载玻片上，制成涂片。干净载玻片上，制成涂片。5 5 5 5、干燥、火焰固定、干燥、火焰固定、干燥、火焰固定、干燥、火焰固定6 6 6 6、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。7 7 7 7、复染：加复红染色、复染：加复红染色、复染：加复红染色、复染：加复红染色1-2
26、1-21-21-2分钟。水洗，吸水纸吸分钟。水洗，吸水纸吸分钟。水洗，吸水纸吸分钟。水洗，吸水纸吸干。干。干。干。、镜检：、镜检：、镜检：、镜检：10101010 x x x x，40 x 40 x 40 x 40 x、100X100X100X100X（油镜）观察。油镜）观察。油镜）观察。油镜）观察。4细菌荚膜的染色细菌荚膜的染色荚膜荚膜荚膜荚膜负染色法：负染色法：负染色法：负染色法：1 1 1 1、制片：取洁净的载玻、制片：取洁净的载玻、制片：取洁净的载玻、制片：取洁净的载玻片一块，加一滴黑墨水，片一块，加一滴黑墨水，片一块，加一滴黑墨水，片一块，加一滴黑墨水，取少量的菌体放入墨水滴取少量的
27、菌体放入墨水滴取少量的菌体放入墨水滴取少量的菌体放入墨水滴中混匀并涂片。中混匀并涂片。中混匀并涂片。中混匀并涂片。2 2 2 2、刮片：另取一载玻片，、刮片：另取一载玻片，、刮片：另取一载玻片，、刮片：另取一载玻片，以三十度角将其边缘浸入以三十度角将其边缘浸入以三十度角将其边缘浸入以三十度角将其边缘浸入黑素中向右端拖动，将黑黑素中向右端拖动，将黑黑素中向右端拖动，将黑黑素中向右端拖动，将黑素涂成一薄层。素涂成一薄层。素涂成一薄层。素涂成一薄层。3 3 3 3、镜检：、镜检：、镜检：、镜检：10101010 x x x x，40 x 40 x 40 x 40 x 物物物物镜观察（注意物镜不要接镜
28、观察（注意物镜不要接镜观察（注意物镜不要接镜观察（注意物镜不要接触黑素，触黑素，触黑素，触黑素，不要用油镜不要用油镜不要用油镜不要用油镜观察）观察）观察）观察）实验报告实验报告1 1 1 1、细菌简单染色、革兰氏染色的原理、方法和步骤。、细菌简单染色、革兰氏染色的原理、方法和步骤。、细菌简单染色、革兰氏染色的原理、方法和步骤。、细菌简单染色、革兰氏染色的原理、方法和步骤。2 2 2 2 记录所观察到的染色结果，并绘图记录所观察到的染色结果，并绘图记录所观察到的染色结果，并绘图记录所观察到的染色结果，并绘图2 2 2 2、思考题、思考题、思考题、思考题 1 1 1 1）制备细菌染色标本时应注意哪
29、些环节？）制备细菌染色标本时应注意哪些环节？）制备细菌染色标本时应注意哪些环节？）制备细菌染色标本时应注意哪些环节？2 2 2 2）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间过长，又会怎样？如果加热温度过高、时间过长，又会怎样？如果加热温度过高、时间过长，又会怎样？如果加热温度过高、时间过长，又会怎样？3 3 3 3）为什么要等制片完全干燥后才能用油镜观察？）为什么要等制片完全干燥后才能用油镜观察？）为什么要等制片完全干燥后才能用油镜观察？）为什么要等制片完全干燥后才能用油镜观察？4 4 4 4）涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？）涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？）涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？）涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？哪一步是关键？哪一步是关键？哪一步是关键？哪一步是关键？Why?Why?Why?Why?