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1、实实 验验 细菌的染色和细菌细胞细菌的染色和细菌细胞构造的观察构造的观察 细菌的染色和细菌细胞构细菌的染色和细菌细胞构造的观察造的观察目的要求目的要求染色剂和染色的原理染色剂和染色的原理实验材料实验材料实验程序实验程序思考题思考题目的要求目的要求学习微生物涂片学习微生物涂片掌握细菌的一般染色发和革兰氏染色掌握细菌的一般染色发和革兰氏染色 进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术 观察和识别细菌细胞的特殊构造观察和识别细菌细胞的特殊构造染色剂和染色原理染色剂和染色原理微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而进行的。微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的
2、作用而进行的。物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。用等。化学因素如：正负离子之间的相互吸引等化学因素如：正负离子之间的相互吸引等染色剂染色剂 染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型：染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型：1.酸性染料：酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。2.碱性染料：碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。美兰、甲基紫等，细菌易被碱
3、性染料染色。3.中性（复合）染料：中性（复合）染料：如伊红、美兰等，如伊红、美兰等，Wright染料和染料和Gimsa染染料等（常用于细胞核染色）。料等（常用于细胞核染色）。4.单纯染色：单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b)的染料。的染料。染色剂和染色原理染色剂和染色原理微生物染色常用染料如下表：微生物染色常用染料如下表：实验材料实验材料涂片染色用的细菌培养物涂片染色用的细菌培养物 .大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli)24h的
4、斜面培养物。的斜面培养物。.枯草杆菌（枯草杆菌（Bacillus subtilis)1216h的斜面培养物。的斜面培养物。载玻片、接种环、镊子、酒精灯、各种染色液、火柴、载玻片、接种环、镊子、酒精灯、各种染色液、火柴、无菌牙签、玻璃铅笔、蒸馏水。无菌牙签、玻璃铅笔、蒸馏水。显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、二甲苯等。显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、二甲苯等。示范片示范片 .苏云金芽孢杆菌（苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的芽孢；的芽孢；.胶质芽孢杆菌（胶质芽孢杆菌（Bacillus mucillaginosus）的荚膜；的荚膜；.枯草芽孢杆菌的鞭毛。枯草芽孢杆菌的鞭
5、毛。实验程序实验程序 （细菌染色的方法和步骤）（细菌染色的方法和步骤）细菌染色的方法细菌染色的方法:.单染色法：单染色法：用一种染色液染菌体后，就可以观察用一种染色液染菌体后，就可以观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。别微生物以及它的特殊构造等。.复染色法：复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、芽孢
6、染色法、鞭毛染色法、细胞染色法等。芽孢染色法、鞭毛染色法、细胞染色法等。染色技术的一般过程染色技术的一般过程 涂片干燥固定染色媒染脱色复染涂片干燥固定染色媒染脱色复染水洗干燥镜检水洗干燥镜检实验程序实验程序 （简单染色的方法和步骤）（简单染色的方法和步骤）简单染色法（一般染色法）简单染色法（一般染色法）.菌种：菌种：牙垢细菌牙垢细菌 .涂片涂片 .干燥：干燥：自然气干或酒精灯自然气干或酒精灯高处微微加热。高处微微加热。固定固定 .染色：染色：在整个涂面上滴加在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色分钟齐氏石炭酸复红，染色分钟。.水洗：水洗：倾去染液，用自来倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染
7、水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。料颜色为止。干燥：干燥：空气中自然干燥。空气中自然干燥。镜检：镜检：在油镜下观察牙垢中的在油镜下观察牙垢中的各种细菌形态并绘图。各种细菌形态并绘图。实验程序实验程序 （革兰氏染色的方法和步骤）（革兰氏染色的方法和步骤）革兰氏（革兰氏（Gram）染色法染色法 1.涂片涂片 2.初染：初染：在做好的涂面上滴加草在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：媒染：先用新配的路哥氏碘液先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。分钟
8、，后水洗。4.脱色：脱色：除去残水后，滴加除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约酒精进行脱色约30秒，后立即用秒，后立即用流水冲洗。流水冲洗。5.复染：复染：滴加番红染色液，染滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。分钟，水洗后用吸水纸吸干。6.镜检：镜检：观察染色结果并绘图。观察染色结果并绘图。实验程序实验程序 （荚膜染色的方法和步骤）（荚膜染色的方法和步骤）荚膜染色法（示范）：荚膜染色法（示范）：荚膜薄，易变形，荚膜薄，易变形，因此在涂片过程中不能用加热固定。因此在涂片过程中不能用加热固定。1.取斜面培养取斜面培养72h左右的胶质芽孢杆菌涂左右的胶质芽孢杆菌涂片，自然干燥，自然固定。片
9、，自然干燥，自然固定。2.染色：染色：在已自然晾干的涂面上，滴加在已自然晾干的涂面上，滴加1%结晶紫染色液染色结晶紫染色液染色2min，以以20%硫酸硫酸铜冲洗数次，再用自来水冲洗铜冲洗数次，再用自来水冲洗1次，晾干。次，晾干。3.镜检：镜检：油镜观察示范片并绘图（菌体油镜观察示范片并绘图（菌体红色，荚膜无色）。红色，荚膜无色）。实验程序实验程序 （鞭毛染色的方法和步骤）（鞭毛染色的方法和步骤）菌液的制备及涂片：菌液的制备及涂片：菌种应预先连续传代菌种应预先连续传代56代。代。1.接种：接种：先在斜面底部加入先在斜面底部加入0.51mL无菌水，取活化的枯草无菌水，取活化的枯草杆菌杆菌12环菌苔
10、，接种于无菌水中，环菌苔，接种于无菌水中，300C 培养培养1518h。2.制备菌液：制备菌液：挑取斜面底部近水面处菌苔数环，移入挑取斜面底部近水面处菌苔数环，移入1mL与与菌种同温的无菌水中，在菌种同温的无菌水中，在280C温箱中保温温箱中保温10min。3.鞭毛涂片：鞭毛涂片：先用悬滴法观察其运动性，若运动性很强，即先用悬滴法观察其运动性，若运动性很强，即可涂片。涂片后自然干燥、固定。可涂片。涂片后自然干燥、固定。染色：染色：染色液必须新配制，涂片必须充分晾干才能染色。染色液必须新配制，涂片必须充分晾干才能染色。1.先用刚过滤的鞭毛染色液先用刚过滤的鞭毛染色液A染染7.58min左右。左右
11、。2.倾去倾去A液，再加鞭毛染色液液，再加鞭毛染色液B液染液染35min，水洗，自然干水洗，自然干燥。燥。.用液石炭酸复红复染用液石炭酸复红复染min，水洗、晾干、镜检。水洗、晾干、镜检。油镜下观察鞭毛的数目及着生情况（示范镜）并绘图油镜下观察鞭毛的数目及着生情况（示范镜）并绘图 （菌体与鞭毛都呈红色，周生鞭毛）。（菌体与鞭毛都呈红色，周生鞭毛）。录录 像像 演演 示示思考题思考题简单染色法中各步骤的注意事项是什么简单染色法中各步骤的注意事项是什么？要得到正确的革兰氏染色结果必须注意要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪几步？为什么？哪些操作？关键在哪几步？为什么？实实 验验 二二结结 束束