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1、基因工程基因工程 基因的克隆基因的克隆-重重组技技术。克隆：是用无性繁殖的方法克隆：是用无性繁殖的方法产生一生一组遗传上相同的上相同的细胞或生物群体的胞或生物群体的过程，而程，而这些些细胞或个体均来自无性胞或个体均来自无性繁殖的繁殖的单一原型一原型细胞。胞。基因的克隆基因的克隆:用重用重组技技术使一个基因或片使一个基因或片段段产生出很多相同拷生出很多相同拷贝的的过程。程。目的基因的表达目的基因的表达连接产物导入受体细胞连接产物导入受体细胞目的基因与载体连接目的基因与载体连接获取目的基因获取目的基因得出结论步骤三：步骤二：步骤一：基因克隆的技术路线的大体步骤一、获取目的基因从染色体中从染色体中获
2、得目的基因得目的基因 1.基因基因组DNA的随机断裂片段的随机断裂片段 2.限制性内切限制性内切酶切割基因切割基因组DNA 3.用反用反转录法合成法合成cDNA人工合成人工合成PCR扩增特定的目的基因片段增特定的目的基因片段基因克隆的载体载体体满足的几个要求：足的几个要求：1.分子相分子相对较小（小（310Kb）能）能进行复制且具有高度拷行复制且具有高度拷贝数数 2.具有几个具有几个单一的一的酶切位点，便于所要切位点，便于所要DNA片段能片段能够连接、接、插入插入载体，体，酶切位点切位点应该在在载体复制子意外适当的位置。体复制子意外适当的位置。3.外源性外源性DNA插入后，插入后，载体在受体体
3、在受体细胞中的复制不受影响。胞中的复制不受影响。4.载体本身体本身应对受体受体细胞无害，以及能接胞无害，以及能接纳尽可能大的外源尽可能大的外源性性DNA片段。片段。5.有便于有便于筛选的明的明显标志，以便于阳性克隆志，以便于阳性克隆细胞容易被胞容易被选出出 6.具有促具有促进外源性外源性DNA表达的表达的调控区。控区。7.生物防生物防护安全，不安全，不污染染环境。境。载体的种类质粒粒 1.大大肠杆菌杆菌质粒粒 2.革革兰氏阳性菌的氏阳性菌的质粒粒噬菌体噬菌体真核真核细胞胞为宿主的克隆宿主的克隆载体体 1.酵母酵母为宿主的宿主的载体体 2.植物植物细胞胞为宿主的宿主的载体体 3.DNA病毒病毒载
4、体体反反转录病毒病毒载体体大肠杆菌的质粒pBR322质粒：它是由粒：它是由4361个核苷酸个核苷酸组成，属于松弛型成，属于松弛型质粒，粒，可以用抗氨可以用抗氨苄西林和抗四西林和抗四环素基因作素基因作为标记，具有多种常用内，具有多种常用内切切酶的切点。的切点。pBR322克隆克隆DNA片段的程序片段的程序质粒作为基因克隆载体应注意：质粒的粒的选择：质粒粒应具具备完成完成实验目的所需的基本目的所需的基本结构，构，如启如启动子、子、顺序、序、终止信号、分泌信号等。其次是止信号、分泌信号等。其次是质粒粒DNA上上应具具备能能满足重足重组用的内切用的内切酶位点。位点。酶切切DNA片段末端的考片段末端的考
5、虑：酶切后形成的切后形成的DNA片段末端有片段末端有黏性末端和平末端。在插入片段和黏性末端和平末端。在插入片段和载体片段末端之体片段末端之间连接接时会出会出现：两个不同黏性末端的：两个不同黏性末端的连接和两个相同黏性末端接和两个相同黏性末端连接；一个黏性一个平末端和两个平末端接；一个黏性一个平末端和两个平末端连接。接。载体的自身体的自身环化：有化：有时发生生酶切切过的的线性性载体体DNA在在酶的的（T4DNA）催化下，）催化下，线性性载体体DNA两黏性末端会重新两黏性末端会重新连接。可以通接。可以通过调整插入片段与整插入片段与载体之体之间的的浓度，在一定程度，在一定程度上可以减少度上可以减少这
6、种种现象。也可以通象。也可以通过磷酸磷酸酯酶处理理线性性载体体DNA。以植物细胞为宿主的基因克隆载体主要主要应用用Ti质粒（根瘤土壤粒（根瘤土壤农杆菌），由于杆菌），由于Ti质粒的宿主粒的宿主广泛，其广泛，其T-DNA可以整合到植物可以整合到植物细胞中，同胞中，同时冠冠瘿氨基酸氨基酸合成合成酶基因启基因启动子能整合到染色体中，因此子能整合到染色体中，因此Ti质粒作粒作为基基因工程的因工程的载体：体：1.在体外将从在体外将从Ti质粒中切割下的粒中切割下的T-DNA插入到另一种插入到另一种质粒粒中，再用内切中，再用内切酶切开切开T-DNA，在，在T-DNA片段中冠片段中冠瘿氨基酸氨基酸合成合成酶启
7、启动子下游子下游处插入外源性基因形成重插入外源性基因形成重组子。子。2.分分别用野生型用野生型ti质粒和上步中的重粒和上步中的重组子来子来转化根瘤土壤化根瘤土壤农杆菌。杆菌。3.在菌体内因在菌体内因为重重组子中的子中的T-DNA和野生型和野生型Ti质粒中的粒中的T-DNA有同源性会有同源性会发生同源重生同源重组、等、等为交交换，从而使野生型，从而使野生型Ti质粒携粒携带了外源性基因。了外源性基因。4.含有外源性基因含有外源性基因的野生型的野生型Ti，可随，可随根瘤土壤根瘤土壤农杆菌感杆菌感染植物而染植物而进入到入到细胞内，同胞内，同时可随可随T-DNA一起整合到植一起整合到植物宿主物宿主细胞的
8、染色胞的染色体中。体中。5.在冠在冠瘿氨基酸合氨基酸合成成酶基因启基因启动子作子作用下，用下，进行高效率行高效率表达，同表达，同时T-DNA中抑制植物分化的中抑制植物分化的作用被外源性基因作用被外源性基因的插入而削弱，从的插入而削弱，从而使植物正常分化。而使植物正常分化。目的基因与载体的连接黏性末端和平末端：黏性末端和平末端：a：沿着中：沿着中轴线切口（即沿着切口（即沿着DNA双双链中中对应的磷酸二的磷酸二酯键）切开，得到的就是两个平末端。）切开，得到的就是两个平末端。b：在中：在中轴线的两端切口切开，得到的就是两的两端切口切开，得到的就是两个黏性末端。个黏性末端。例如例如:EcoRI限制性内
9、切限制性内切酶就可以就可以识别G/AATTC的的DNA序列，然后在序列，然后在G和和A间切切开，得到的就是两个黏性末端。（之开，得到的就是两个黏性末端。（之间可以根可以根据碱基互据碱基互补配配对原原则重重组）限制限制酶的切口不都是一的切口不都是一长一短的一短的,一一长一短的一短的叫黏性末端叫黏性末端,一一样长的叫平末端。的叫平末端。黏性末端和平末端：黏性末端和平末端：黏性末端的连接：单酶切黏性末端的连接单酶切黏性末端的连接双酶切黏性末端的连接双酶切黏性末端的连接平末端的连接（转化成黏性末端）由于连接平由于连接平末端末端DNA片片段时，所需段时，所需底物浓度高，底物浓度高，且连接效率且连接效率低
10、。所以一低。所以一般需要进行般需要进行修饰或改造修饰或改造形成黏性末形成黏性末端后再进行端后再进行连接。连接。图图为为人人工工接接头头连连接接法法利用适配子来重组DNA分子连接产物导入受体细胞（细菌）氯化化钙法将其法将其导入受体入受体细胞：胞：利用利用氯化化钙和和热休克使受休克使受体菌成体菌成为感受感受态细胞，促胞，促进外源外源 DNA进入。入。感受感受态细胞：宿主胞：宿主细胞与重胞与重组DNA在在0摄氏度的氏度的氯化化钙溶液中孵育，快速溶液中孵育，快速转入入42摄氏度造成氏度造成热休克。休克。经此此处理理后的后的细胞胞“容易容易”接受外源基因，一般叫做感受接受外源基因，一般叫做感受态细胞。胞
11、。处于感受于感受态的的细菌表面正菌表面正电荷增加，荷增加，细胞膜的胞膜的结构有改构有改变，通透性增通透性增强，转化子易于化子易于进入入细胞。胞。连接产物导入受体细胞（真核细胞）借助于借助于载体的基因体的基因转移：主要是以重移：主要是以重组的的动植物植物病毒、反病毒、反转录病毒及侵染植物的病毒及侵染植物的农杆菌杆菌Ti质粒直粒直接接传染受体染受体细胞，把外源基因引入。胞，把外源基因引入。不需借助不需借助载体的基因体的基因转移：移：1.磷酸磷酸钙沉淀法沉淀法 2.脂脂质体介体介导法法 3.血影血影细胞介胞介导法法 4.电穿孔穿孔转移法移法 磷酸磷酸钙沉淀法的原理：将沉淀法的原理：将转移基因的移基因
12、的DNA溶液与溶液与适量的适量的氯化化钙溶液混合，再加入一定量的磷酸溶液混合，再加入一定量的磷酸盐溶溶液，逐步生成磷酸液，逐步生成磷酸钙-DNA沉淀复合物。将适量的沉淀复合物。将适量的沉淀复合物加入到沉淀复合物加入到细胞培养液中，通胞培养液中，通过细胞的胞胞的胞饮作用作用进入到入到细胞胞质或或进而而转移到移到细胞核中，然后整胞核中，然后整合到染色体上。合到染色体上。脂脂质体介体介导法法:脂脂质体是磷脂在水中形成的一种有体是磷脂在水中形成的一种有脂脂类双分子双分子层围成的囊状脂成的囊状脂质小泡小泡结构，其外周是构，其外周是脂双脂双层，内部是水腔。它可以与，内部是水腔。它可以与 DNA 分子通分子
13、通过静静电结合或直接把合或直接把 DNA 分子包裹在其内，并通分子包裹在其内，并通过细胞膜把基因运送到胞膜把基因运送到细胞内，胞内，实现外源基因的有效外源基因的有效转染。染。血影血影细胞介胞介导法法:血影血影细胞是指哺乳胞是指哺乳动物的物的红细胞胞在机械作用、病毒在机械作用、病毒诱导、低渗等条件下、低渗等条件下发生溶血生溶血且使血且使血红蛋白大量溢出，最后形成蛋白大量溢出，最后形成仅有被有被细胞膜胞膜包被的包被的细胞胞结构。在溶血构。在溶血过程中由于外界的作用程中由于外界的作用使使细胞膜的通透性加胞膜的通透性加强，不，不仅血血红蛋白溢出，外蛋白溢出，外源基因也容易源基因也容易进入；当外界条件入
14、；当外界条件发生改生改变后，后，红细胞膜又可以恢复原来的胞膜又可以恢复原来的选择通透性。外源基因通透性。外源基因血影血影细胞胞 受体受体细胞胞融合基因融合基因导入入电穿孔穿孔转移法：在一定移法：在一定强度的脉冲度的脉冲电压刺激下，刺激下，细胞膜胞膜发生生临时性破裂而形成微小洞，从而性破裂而形成微小洞，从而导致致外源基因通外源基因通过细胞膜胞膜 进入入细胞内胞内实现外源基因的外源基因的转移。移。重组子的筛选与鉴定几种常用的重几种常用的重组分子的分子的筛选方法：方法：抗抗药性性标记插入失活插入失活标记法法半乳糖苷半乳糖苷酶显色反色反应筛选法法原位原位杂交交免疫法免疫法筛选抗药性标记插入失活标记法目
15、的基因插入目的基因插入到抗四环素基到抗四环素基因的位置，则因的位置，则导入菌体后的导入菌体后的菌株则不能在菌株则不能在有四环素的培有四环素的培养基上生长养基上生长 半乳糖苷酶显色反应筛选法多多克克隆隆位位点点完整的完整的LacZ基基因内，经过改因内，经过改造加入了多克造加入了多克隆位点，但并隆位点，但并不影响不影响LacZ基基因的表达。因的表达。当质粒转化细胞后，完当质粒转化细胞后，完整的整的LacZ基因表达产基因表达产物与细菌的有关基因表物与细菌的有关基因表达产物共同组成有功能达产物共同组成有功能的半乳糖苷酶，该酶把的半乳糖苷酶，该酶把无色的无色的X-gal切割成半切割成半乳糖和蓝色的乳糖和
16、蓝色的5-溴溴-4-氯氯-靛蓝，使得菌落呈现蓝靛蓝，使得菌落呈现蓝色。色。X-gal：5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-B-D-半乳糖苷半乳糖苷表示表示外源外源基因基因插入插入编码编码半乳半乳糖苷糖苷酶的酶的基因基因区段区段带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落使用含使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。1.载体自身环化，产生蓝色菌落；载体自身环化，产生蓝色菌落；2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。3 未转化的细胞，不能生长。未转化的细
17、胞，不能生长。对对照照目目的的基基因因本本身身不不能能是是培培养养基基变变色色原位杂交生生长在在琼脂糖平板上的菌落，可定点脂糖平板上的菌落，可定点转移到硝移到硝酸酸纤维素膜上，加入放射性的探素膜上，加入放射性的探针（即（即带有有 放射性的与目的片断互放射性的与目的片断互补的核酸片断），与菌的核酸片断），与菌落落杂交。交。经洗洗涤后的膜与后的膜与X光胶片作用，挑光胶片作用，挑选出阳性克隆。出阳性克隆。免疫法筛选原理原理 目的基因目的基因编码的蛋白的蛋白质作作为抗原，用特异性抗体抗原，用特异性抗体与之反与之反应，再根据，再根据颜色等色等变化，化，筛选出菌落。出菌落。方法方法 在在琼脂平板上的菌落，
18、脂平板上的菌落，转移到尼移到尼龙滤膜上，若膜上，若某菌落某菌落带有目的基因，并可表达有目的基因，并可表达该目的基因所目的基因所编码的的蛋白蛋白质，则加入加入该蛋白蛋白质的特异抗体，可与的特异抗体，可与该菌落菌落结合，附着在合，附着在滤膜上，不会被洗掉。膜上，不会被洗掉。该抗体可携抗体可携带酶或或荧光，易于光，易于检测。基因表达产物的鉴定基因表达：指某基因在基因表达：指某基因在细胞中胞中转录为mRNA继而翻而翻译成蛋白成蛋白质的的过程。程。DNARNAProtein转录转录翻译翻译研究基因表达的手段1、RT-PCR(RNA)2、Northern blot(RNA)3、Western blot(蛋
19、白蛋白质）4、免疫、免疫组化化（蛋白（蛋白质）1、RT-PCR基本原理：基本原理：将将细胞中胞中mRNA逆逆转录为cDNA，以，以cDNA为模板，模板，进行行PCR反反应。根据。根据PCR产物的量，判断基因物的量，判断基因表达的表达的强度。度。mRNAcDNAPCR产物产物2、Northern blot标记探探针与膜固相与膜固相RNA杂交。交。根据根据杂交信号交信号强弱判断表达量，弱判断表达量，根据根据杂交信号位置判断分子交信号位置判断分子长度。度。实验操作：操作：1）RNA提取提取2）RNA电泳（分离不泳（分离不同同长度度RNA)3）转膜膜(形成固相形成固相RNA)4）探）探针标记（同位素（
20、同位素/非同位素）非同位素）5）杂交交6）洗膜）洗膜7）显影（放射性影（放射性/酶促反促反应）优点：因点：因为没有没有扩增增过程，程，Northern blot 的的结果果可靠性高。可以确定未知基因的可靠性高。可以确定未知基因的转录产物物（mRNA）长度。度。缺点：缺点：1、操作、操作烦琐2、使用同位素可能、使用同位素可能污染染环境境3、灵敏度低、灵敏度低4、对RNA质量要求高量要求高、Western blot标记抗体与固定在膜上的蛋白作用。抗体与固定在膜上的蛋白作用。根据信号根据信号强弱判断蛋白表达弱判断蛋白表达强度。度。根据信号位置判断蛋白分子量。根据信号位置判断蛋白分子量。标准分子量标准分子量蛋白蛋白特异性反应带特异性反应带优点：优点：直接检测蛋直接检测蛋白质的表达白质的表达量。量。缺点：缺点：灵敏度低灵敏度低一抗制备难一抗制备难度大，购买度大，购买价格高价格高氨基酸序列测定测定定N端的端的1015个氨基酸个氨基酸测定定C端的端的5个氨基酸个氨基酸样品需精制品需精制价格价格较高高 谢谢大家大家