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1、第三章第三章 基因克隆载体基因克隆载体 第三节第三节 染色体定位整合克隆载体染色体定位整合克隆载体 质粒与病毒克隆载体的不足：质粒与病毒克隆载体的不足：1、外源、外源DNA的不稳定性的不稳定性 2、外源、外源DNA插入染色体插入染色体DNA位点的随机性位点的随机性基因整合平台系统基因整合平台系统基因定位同源重组基因定位同源重组(基基因打靶因打靶)u整合平台：整合平台：即受体细胞基因组上给定的即受体细胞基因组上给定的DNA区域，是外源区域，是外源DNA 定位整合的位置定位整合的位置 u定位整合克隆载体：定位整合克隆载体：除一般质粒克隆载除一般质粒克隆载体必备的元件外，还含有一个或两个与整合体必备
2、的元件外，还含有一个或两个与整合平台平台DNA区域核酸序列同源的区域核酸序列同源的DNA片段（长片段（长度最好度最好1kb）一、定位整合克隆载体的几种模式一、定位整合克隆载体的几种模式（一）内源平台双交换置换克隆载体（一）内源平台双交换置换克隆载体（一）内源平台双交换置换克隆载体（一）内源平台双交换置换克隆载体（二）外源平台双交换置换克隆载体（二）外源平台双交换置换克隆载体（二）外源平台双交换置换克隆载体（二）外源平台双交换置换克隆载体（三）内源平台双交换插入克隆载体（三）内源平台双交换插入克隆载体（三）内源平台双交换插入克隆载体（三）内源平台双交换插入克隆载体（四）内源平台单交换插入克隆载体
3、（四）内源平台单交换插入克隆载体（四）内源平台单交换插入克隆载体（四）内源平台单交换插入克隆载体二、定位整合效率二、定位整合效率 n n与受体细胞的种属和同源与受体细胞的种属和同源与受体细胞的种属和同源与受体细胞的种属和同源DNADNADNADNA片段的长短有关片段的长短有关片段的长短有关片段的长短有关 n n整合效率偏低，有待改进整合效率偏低，有待改进整合效率偏低，有待改进整合效率偏低，有待改进 三、定位整合克隆载体三、定位整合克隆载体 受体生物：受体生物：原核生物蓝细菌、高等植物（拟原核生物蓝细菌、高等植物（拟南芥、水稻等）的原生质体、动物鼠的胚南芥、水稻等）的原生质体、动物鼠的胚胎干细胞
4、、人的细胞胎干细胞、人的细胞 整合平台整合平台：内源内源isiABisiAB、cpcB2A2cpcB2A2、hprthprt、rDNA rDNA 外源外源hpthpt、aphaph（一）蓝藻染色体定位整合克隆载体（一）蓝藻染色体定位整合克隆载体 1 1、丝状蓝藻获得含藻蓝蛋白基因、丝状蓝藻获得含藻蓝蛋白基因cpcB2A2cpcB2A2的的DNADNA片片段，以之为同源序列，构建段，以之为同源序列，构建2 2、从其、从其cpc2cpc2操纵子中扩赠出操纵子中扩赠出cpc2cpc2启动区（约）、启动区（约）、同源同源DNADNA片段片段L L（约）和（约）和R R（约）构建如下载体：（约）构建如下
5、载体：3 3 3 3、Synechococcus Synechococcus Synechococcus Synechococcus 从获得含从获得含从获得含从获得含isiABisiABisiABisiAB基因的约的基因的约的基因的约的基因的约的DNADNADNADNA片段，构建片段，构建片段，构建片段，构建p ZLp ZLp ZLp ZL：不含蓝藻源质粒复制起始位点，故不能在蓝藻细胞质中自不含蓝藻源质粒复制起始位点，故不能在蓝藻细胞质中自不含蓝藻源质粒复制起始位点，故不能在蓝藻细胞质中自不含蓝藻源质粒复制起始位点，故不能在蓝藻细胞质中自行复制行复制行复制行复制（二）酵母菌染色体定位整合克隆载
6、体（二）酵母菌染色体定位整合克隆载体（三）植物染色体定位整合克隆载体（三）植物染色体定位整合克隆载体 易于控制；避免插入失活或突变。易于控制；避免插入失活或突变。（四）动物染色体定位整合克隆载体（四）动物染色体定位整合克隆载体 第四节第四节 人工染色体克隆载体人工染色体克隆载体 一、人工染色体克隆载体含义和特点一、人工染色体克隆载体含义和特点 “穿梭穿梭穿梭穿梭”克隆载体：克隆载体：克隆载体：克隆载体：含有质粒克隆载体所必备含有质粒克隆载体所必备含有质粒克隆载体所必备含有质粒克隆载体所必备的的的的第一受体第一受体第一受体第一受体（大肠杆菌）源质粒复制起始位点（大肠杆菌）源质粒复制起始位点（大肠
7、杆菌）源质粒复制起始位点（大肠杆菌）源质粒复制起始位点（oriorioriori），还含有），还含有），还含有），还含有第二受体第二受体第二受体第二受体（如酵母菌）染色体（如酵母菌）染色体（如酵母菌）染色体（如酵母菌）染色体DNADNADNADNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。合适的选择标记基因。合适的选择标记基因。合适的选择标记基因。特点：特点：特点：特点：能容纳长达能容纳长达能容纳长达能容纳长达1000100010001000至至至至3000kb30
8、00kb3000kb3000kb的外源的外源的外源的外源DNADNADNADNA片段。片段。片段。片段。二、人工染色二、人工染色体克隆载体的体克隆载体的构建构建 YACYAC（酵母人工（酵母人工（酵母人工（酵母人工染色体）染色体）染色体）染色体）常用载体：常用载体：常用载体：常用载体：pYAC3pYAC3、pYAC4 pYAC4、pYAC5pYAC5三、人工染色体克隆载体的应用三、人工染色体克隆载体的应用 n n构建基因组文库构建基因组文库 n n基因治疗基因治疗 n n基因功能鉴定基因功能鉴定 作作 业业n n列举所学的几种重要克隆载体的定义。列举所学的几种重要克隆载体的定义。n n各种载体的特点是什么？各种载体的特点是什么？n n列举质粒和噬菌体克隆载体构建的基本策列举质粒和噬菌体克隆载体构建的基本策略。略。n n简述使用简述使用cosmidcosmid载体的基本程序。载体的基本程序。