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1、第一章第一章菌种及培养基灭菌菌种及培养基灭菌第一节菌种及其扩大培养第一节菌种及其扩大培养一、微生物工业用菌种一、微生物工业用菌种(一一)、微生物工业对菌种的要求、微生物工业对菌种的要求1 1、能能在在廉廉价价原原料料制制成成的的培培养养基基上上迅迅速速生生长长和和生生成所需的代谢产物产量高的菌种；成所需的代谢产物产量高的菌种；2 2、可以在要求不高、易于控制的培养条件下、可以在要求不高、易于控制的培养条件下(糖糖浓度、温度、浓度、温度、pHpH值、溶解氧、渗透压等值、溶解氧、渗透压等)迅速生迅速生长和发酵，且所需的酶活性高，特别是在华南地长和发酵，且所需的酶活性高，特别是在华南地区建厂，夏季气
2、温炎热，宜选择耐高温的菌种；区建厂，夏季气温炎热，宜选择耐高温的菌种；3 3、生长速度和反应速度较快，发酵周期较短菌株；、生长速度和反应速度较快，发酵周期较短菌株；4 4、根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变、根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株；菌株或调节突变菌株或野生菌株；5 5、选择抗噬菌体能力强的菌株，使不易感染噬菌体；、选择抗噬菌体能力强的菌株，使不易感染噬菌体；6 6、菌种纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质、菌种纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性；量的稳定性；7 7、菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物
3、质和、菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素毒素(包括抗生素、激素和毒素等包括抗生素、激素和毒素等)，以保证安全。，以保证安全。(二二)、常用微生物、常用微生物微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、食微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工等方品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工等方面。微生物总的面。微生物总的10左右。微生物的代谢产物据统左右。微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种，而大规模工业生产的总计计已超过一千三百多种，而大规模工业生产的总计不超过一百多种；微生物酶有近干种，而已在工业不超过一百多种；微生物酶有近干种，而
4、已在工业上利用的不过四五十种。可见，微生物资源不仅十上利用的不过四五十种。可见，微生物资源不仅十分丰富，而且可挖掘的潜力还是很大的。分丰富，而且可挖掘的潜力还是很大的。二、种子扩大培养二、种子扩大培养(一一)、扩大培养的目的、扩大培养的目的1、现现代代的的发发酵酵工工业业生生产产规规模模越越来来越越大大，每每只只发发酵酵罐罐的的容容积积有有几几十十立立方方米米甚甚至至几几百百立立方方米米，要要使使小小小小的的微微生生物物在在几几十十小小时时的的较较短短时时间间内内，完完成成如如此此巨巨大大的的发发酵酵转转化化任任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行
5、。2、菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料，、菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料，提供相当数量的代谢旺盛的种子。因为发酵时间的长短提供相当数量的代谢旺盛的种子。因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐利用率，并且也有利于减少染菌的机会。间，提高发酵罐利用率，并且也有利于减少染菌的机会。要得到纯而壮的培养物，而且要获得活力旺盛的、接种要得到纯而壮的培养物，而且要获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。数
6、量足够的培养物。(二二)、种子罐级数的确定、种子罐级数的确定1、确定原则确定原则(1)种子罐的级数愈少，愈有利于简化工艺及控制。种子罐的级数愈少，愈有利于简化工艺及控制。级数少可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消毒级数少可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消毒及值班工作量以及减少因种子罐生长异常而造成及值班工作量以及减少因种子罐生长异常而造成发酵的波动。发酵的波动。(2)应当考虑到如何才能最低限度地占用发酵罐中应当考虑到如何才能最低限度地占用发酵罐中非合成代谢产物的运转周期。所以种子罐级数的非合成代谢产物的运转周期。所以种子罐级数的决定取决于菌种的性质决定取决于菌种的性质(如菌种传代后的稳定性如菌种
7、传代后的稳定性)、孢子瓶中的孢子数、孢子发芽及菌丝繁殖速度、孢子瓶中的孢子数、孢子发芽及菌丝繁殖速度以及发酵罐中种子培养液的最低接种量和种子罐以及发酵罐中种子培养液的最低接种量和种子罐与发酵罐的容积比。与发酵罐的容积比。如果孢子瓶中的孢子数量较多，如果孢子瓶中的孢子数量较多，孢子在种子罐中发育较快，且对发酵罐的最低接孢子在种子罐中发育较快，且对发酵罐的最低接种量的要求亦较小，显然可采用二级发酵流程。种量的要求亦较小，显然可采用二级发酵流程。(3)(3)种子罐的级数随产物的品种及生产规模而定，种子罐的级数随产物的品种及生产规模而定，也随着工艺条件的改变作适当的调整。例如改变也随着工艺条件的改变作
8、适当的调整。例如改变种子罐的培养条件，加速孢子的发育或改进孢子种子罐的培养条件，加速孢子的发育或改进孢子瓶的培养工艺后可大大增加孢子数量等，在此基瓶的培养工艺后可大大增加孢子数量等，在此基础上均有可能使三级发酵简化为二级发酵。础上均有可能使三级发酵简化为二级发酵。1、实例实例(1)放线菌放线菌(抗生素生产抗生素生产)放放线线菌菌的的细细胞胞生生长长繁繁殖殖速速度度较较慢慢，常常常常用用三三级级种种子子扩扩大大培培养养，即即将将种种子子罐罐中中之之菌菌丝丝移移植植到到较较大大的的种种子子罐罐中中扩扩大大培培养养后后，再再移移入入发发酵酵罐罐中中，这这种种流流程程称称为为三三级级发发酵酵。一一般般
9、50t发发酵酵罐罐多多采采用用三三级级发发酵酵，有有的的甚甚至至采采用用四四级级发发酵酵，如如链霉素生产。链霉素生产。(2)霉菌（酶制剂）霉菌（酶制剂）酶制剂发酵生产也采用三级发酵。酶制剂发酵生产也采用三级发酵。(3)细菌细菌(谷氨酸谷氨酸)谷谷氨氨酸酸及及其其他他氨氨基基酸酸发发酵酵所所用用的的菌菌种种是是细细菌菌，生生长长繁繁殖殖速度很快，所以采用二级发酵。二级发酵的流程如下：速度很快，所以采用二级发酵。二级发酵的流程如下：斜面菌种斜面菌种-一级种子摇床培养一级种子摇床培养-二级种子罐培养二级种子罐培养-发酵罐发酵罐三、三、种子培养方法种子培养方法(一一)、一级种子培养方法、一级种子培养方
10、法1、液体培养法：三角瓶摇床振荡或回转式培养。液体培养法：三角瓶摇床振荡或回转式培养。2、表面法培养：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。表面法培养：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。3、固态法培养：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养固态法培养：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养。皿等麸皮培养。(二二)、二级及多级种子培养方法、二级及多级种子培养方法1、固固体体培培养养固固体体培培养养又又可可分分为为浅浅盘盘固固体体培培养养和和深深层层固固体培养，统称曲法培养体培养，统称曲法培养2、液液体体深深层层培培养养液液体体深深层层培培养养的的特特点点是是容容易易按按照照生生产产菌菌种种对对于于代代谢谢的的营营养养要要求
11、求以以及及不不同同生生理理时时期期的的通通气气、搅搅拌拌、温温度度与与培培养养基基中中氢氢离离子子浓浓度度等等影影响响，选选择择最最佳佳培培养养条条件件，因因此此，目目前前几几乎乎所所有有好好气气性性发发酵酵都都采采取取液液体体深深层层培培养养法法。现现在在发发酵酵罐罐的的容容积积最最大大为为5001000t，溶溶解解氧氧、温度、温度、pH值等均有自控仪器。值等均有自控仪器。3、载载体体培培养养以以天天然然或或人人工工合合成成的的多多孔孔材材料料代代替替麸麸皮皮之之类类的的固固态态基基质质作作为为微微生生物物生生长长的的载载体体，营营养养成成分分可可以以严严格控制。格控制。两步法液体深层培养两
12、步法液体深层培养每一步菌体相同而培养条件不同，每一步菌体相同而培养条件不同，因为微生物生长与产酶的最适条件往往有很大差异。因为微生物生长与产酶的最适条件往往有很大差异。四、影响种子质量的因素四、影响种子质量的因素1、培养基、培养基(1)不不同同类类型型的的微微生生物物所所需需要要的的培培养养基基成成分分与与浓浓度度配配比比并不完全相同，产量提高是选择培养基的一个重要标准。并不完全相同，产量提高是选择培养基的一个重要标准。(2)种种子子罐罐是是培培养养菌菌体体的的，培培养养基基的的糖糖分分要要少少而而对对微微生生物物生生长长起起主主导导作作用用的的氮氮源源要要多多而而且且其其中中无无机机氮氮源源
13、所所占的比例要大些。占的比例要大些。（3)种种子子罐罐和和发发酵酵罐罐的的培培养养基基成成分分可可相相同同也也可可不不同同，相相同同也也有有益益处处。这这样样可可使使处处于于对对数数生生长长期期的的菌菌种种移移植植在在适适宜的环境中发酵，可以大大缩短其生长过程的缓慢期。宜的环境中发酵，可以大大缩短其生长过程的缓慢期。（4)对对于于某某一一菌菌种种和和具具体体设设备备条条件件来来说说，最最适适宜宜的的配配比比完全应该进行多因素的优选，完全应该进行多因素的优选，通通过过对对比比试试验验去去确确定定。如如果果菌菌种种的的特特性性或或设设备备条条件件(如如罐罐型型、搅搅拌拌的的形形式式和和转转速速等等
14、)变变化化较较大大，则则培培养养基基配配比比应应通通过过试试验验相相对对地地变变更更：只只有有培培养养基基各各成成分分的的关关系系选选得比较恰当，才能最大地发挥菌种的特性，提高产量得比较恰当，才能最大地发挥菌种的特性，提高产量2、种龄与接种量、种龄与接种量（1）种龄种龄种子培养期应取菌种的对数生长期为宜种子培养期应取菌种的对数生长期为宜（2）接种量接种量大量地接入成熟的菌种，可以缩短生长大量地接入成熟的菌种，可以缩短生长过程的缓慢期，因而缩短发酵周期，节约了发酵培养过程的缓慢期，因而缩短发酵周期，节约了发酵培养的动力消耗，提高了设备利用率，并有利于减少染菌的动力消耗，提高了设备利用率，并有利于
15、减少染菌机会。接种量过多也无必要，因种子培养费时，而且机会。接种量过多也无必要，因种子培养费时，而且过多地移入代谢废物，反而会影响正常发酵。过多地移入代谢废物，反而会影响正常发酵。3、温度温度4、pH值值(1)各各种种微微生生物物都都有有自自己己生生长长与与合合成成酶酶的的最最适适pH值值。同同一一菌菌种种合合成成酶酶的的类类型型与与酶酶系系组组成成可可以以随随pH值的改变而产生不同程度的变化。值的改变而产生不同程度的变化。(2)氮氮源源被被利利用用后后NH3的的产产生生，则则pH值值上上升升；阳阳离离子子(如如NH4+，K+)被被吸吸收收或或有有机机酸酸的的积积累累，则则pH值值下下降降。一
16、一般般来来说说，高高碳碳源源培培养养基基倾倾向向于于向向酸酸性性pH值值转转移移，高高氮氮源源培培养养基基倾倾向向于于向向碱碱性性pH值值转移，这都跟碳氮比直接有关。转移，这都跟碳氮比直接有关。(3)必须保持适当的必须保持适当的pH值。调节方法有三种，即值。调节方法有三种，即使用酸碱溶液、缓冲液以及各种生理缓冲剂使用酸碱溶液、缓冲液以及各种生理缓冲剂(如如生理酸性与生理碱性的盐类生理酸性与生理碱性的盐类)。5、通气和搅拌、通气和搅拌(1)、不不同同微微生生物物要要求求通通气气量量不不同同，即即使使是是同同一一菌菌种，不同生理时期对通气量的要求也不相同。种，不同生理时期对通气量的要求也不相同。(
17、2)、通通气气量量与与菌菌种种、培培养养基基性性质质以以及及培培养养阶阶段段有有关。关。(3)、氧氧溶溶解解的的速速度度大大于于菌菌体体的的吸吸氧氧量量时时，菌菌体体才才能能正正常常地地生生长长和和合合成成酶酶，否否则则氧氧的的溶溶解解比比消消耗耗少少，氧氧的的浓浓度度降降低低，降降到到某某一一浓浓度度(称称溶溶解解氧氧的的临临界界点点)，菌体生长就减慢。，菌体生长就减慢。(4)、培养罐深、搅拌转速大、通气管开孔小或多、培养罐深、搅拌转速大、通气管开孔小或多、培养基的粘度越小氧的溶解速度也越大。培养基的粘度越小氧的溶解速度也越大。6泡沫与染菌泡沫与染菌（1）泡泡沫沫形形成成原原因因通通气气和和
18、机机械械搅搅拌拌使使液液体体分分散散和和空空气气窜窜入入形形成成气气泡泡，培培养养基基中中某某些些成成分分的的变变化化或或微微生生物物的的代代谢谢活活动动产产生生气气泡泡，培培养养基基中中某某些些成成分分(如如蛋蛋白白质质及及其其他他胶胶体体物物质质)的的分分子子在在气气泡泡表表面面排排列列形形成成坚坚固固的的薄薄膜膜，因因此此，气泡不易破裂，聚成泡沫层。气泡不易破裂，聚成泡沫层。(2)消消泡泡措措施施主主要要偏偏重重于于化化学学方方法法和和机机械械消消泡泡。消消泡泡剂剂有有动动植植物物油油以以及及来来自自石石油油化化工工生生产产的的矿矿物物油油、改改性性油油、表表面面活活性性剂剂、有有机机硅
19、硅聚聚合合物物如如硅硅油油、硅硅酮酮树树脂脂等等。泡泡沫沫的的控控制制除除了了添添加加消消泡泡剂剂外外，改改进进培培养养基基成成分分也也是是相相辅辅相相成的一个重要方面。成的一个重要方面。(3)染菌原因染菌原因设备本身结构存在设备本身结构存在“死角死角”、设备、管道、设备、管道、阀门漏损、灭菌不彻底，空气净化不好、无菌操作不严阀门漏损、灭菌不彻底，空气净化不好、无菌操作不严或菌种不纯等问题或菌种不纯等问题第二节第二节前提物质及促进剂前提物质及促进剂 一、生物合成的前提物质一、生物合成的前提物质1、前前体体物物质质的的利利用用往往往往与与菌菌种种的的特特性性和和菌菌龄龄有关。有关。2、当前体物质
20、是合成过程中的限制因素时，、当前体物质是合成过程中的限制因素时，前体物质加入量越多，抗生素产量就越高。前体物质加入量越多，抗生素产量就越高。但前体物质的浓度越大，利用率越低。但前体物质的浓度越大，利用率越低。二、发酵过程的促进剂二、发酵过程的促进剂1、对产酶影响、对产酶影响酶制剂发酵过程中，某些诱导物、表面活性剂及其他酶制剂发酵过程中，某些诱导物、表面活性剂及其他一些产酶促进剂，可以大大增加菌体的产酶量。一些产酶促进剂，可以大大增加菌体的产酶量。添加诱导物，对产诱导酶添加诱导物，对产诱导酶(如水解酶类如水解酶类)的微生物来说，的微生物来说，可使原来很低的产酶量大幅度地提高，这在生产酶制剂可使原
21、来很低的产酶量大幅度地提高，这在生产酶制剂新品种时尤其明显。一般的诱导物是相应酶的作用底物新品种时尤其明显。一般的诱导物是相应酶的作用底物或一些底物类似物，这些物质可以或一些底物类似物，这些物质可以“启动启动”微生物体内微生物体内的产酶机构，如果没有这些物质，这种机构通常是没有的产酶机构，如果没有这些物质，这种机构通常是没有活性的，产酶是受阻抑的。活性的，产酶是受阻抑的。常用的促进剂有各种表面活性剂常用的促进剂有各种表面活性剂(洗净剂、吐洗净剂、吐温温80、植酸、洗衣粉等、植酸、洗衣粉等)、二乙胺匹乙酸、大豆、二乙胺匹乙酸、大豆油精抽提物、黄血盐、甲醇等。油精抽提物、黄血盐、甲醇等。2、对合成
22、抗生素的影响、对合成抗生素的影响(1)有的可能起生长因素的作用；有的可能起生长因素的作用；(2)有的可推迟菌体的自溶；有的可推迟菌体的自溶；(3)有有的的是是抑抑制制了了某某些些合合成成其其他他产产物物的的途途径径而而使使之之向所需产物的途径转化；向所需产物的途径转化；(4)有有的的是是降降低低了了产产生生菌菌的的呼呼吸吸，使使之之有有利利于于抗抗生生素的合成；素的合成；(5）有的可改变发酵液的物理性质，改善通气效果；）有的可改变发酵液的物理性质，改善通气效果；(6)有的可与抗生素形成复盐，从而降低发酵液中有的可与抗生素形成复盐，从而降低发酵液中抗生素的浓度和促进抗生素的合成。抗生素的浓度和促
23、进抗生素的合成。3、对氨基酸发酵的影响、对氨基酸发酵的影响（1）防止噬菌体污染。）防止噬菌体污染。（2）防止营养缺陷菌株发生回复突变。）防止营养缺陷菌株发生回复突变。第三节第三节 培养基灭菌培养基灭菌一、培养基为什么要灭菌一、培养基为什么要灭菌生物反应系统中通常含有比较丰富的营养物生物反应系统中通常含有比较丰富的营养物质，因而很容易受到杂苗污染，而产生质，因而很容易受到杂苗污染，而产生各种不良各种不良后果：后果：1)由于杂菌的污染，使生物反应的基质或产物，由于杂菌的污染，使生物反应的基质或产物，因杂苗的消耗而损失，造成生产能力的下降；因杂苗的消耗而损失，造成生产能力的下降；2)由于杂菌所产生的
24、一些代谢产物，或在染菌由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了发酵液的某些理化性质，使产物的提取变后改变了发酵液的某些理化性质，使产物的提取变得困难，造成收得率降低，或使产品质量下降；得困难，造成收得率降低，或使产品质量下降；3)污染的杂菌可能会分解产物，而使生产失败；污染的杂菌可能会分解产物，而使生产失败；4)污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH，从而使生物反应发生异常变化；从而使生物反应发生异常变化；5)发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失活等等。失活等等。二、达到无菌培养所采取的措施二、达到无
25、菌培养所采取的措施1)使用的培养基和设备须经灭菌；使用的培养基和设备须经灭菌；2)好气培养过程中使用的空气应经除菌处理；好气培养过程中使用的空气应经除菌处理；3)设备应严密，生物反应器中要维持高于环境的设备应严密，生物反应器中要维持高于环境的压力；压力；4)培养过程中加入的物料应经过灭菌；培养过程中加入的物料应经过灭菌；5)使用无污染的纯粹种子等。使用无污染的纯粹种子等。三三灭菌的方法灭菌的方法所谓灭茵，就是指用物理或化学方法杀灭或去除所谓灭茵，就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。物料或设备中一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法有以下几种：常用的灭菌方法有以下几种
26、：(1)化学药剂灭菌化学药剂灭菌(2)射线灭菌射线灭菌紫外线紫外线(3)干热灭菌干热灭菌（4）湿热灭菌）湿热灭菌（5）过滤除菌）过滤除菌四、培养基灭菌动力学四、培养基灭菌动力学（一）、灭菌原理（一）、灭菌原理1、对数残留定律、对数残留定律dN/dt=kN积分后得：积分后得：lnN/N0=-kt或：或：N=N0e-kt2、T对对K的影响的影响据阿累尼乌斯方程：据阿累尼乌斯方程：K=Ae-E/RTlnK=-(E/RT)+lnA据上式有结论：据上式有结论：（1）E愈愈高高，K愈愈低低，菌菌死死亡亡慢慢。营营养养成成分分失失活活的的E很低）很低）（2）培培养养基基成成分分的的失失活活与与灭灭菌菌的的矛
27、矛盾盾。介介绍绍如如何何协协调调及及原因。原因。（3）K与温度成比例关系。与温度成比例关系。微生物微生物相对抵抗力相对抵抗力细菌与酵母的营养细胞细菌与酵母的营养细胞1细菌孢子细菌孢子3106霉菌孢子霉菌孢子210病毒与噬菌体病毒与噬菌体153、灭菌与营养成分破坏的关系、灭菌与营养成分破坏的关系从上表可以看出：细菌孢子的热死灭反从上表可以看出：细菌孢子的热死灭反应的活化能很高，而营养成分的热破坏应的活化能很高，而营养成分的热破坏的活化能较低。的活化能较低。营养成分的热破坏也遵循一级反应动力营养成分的热破坏也遵循一级反应动力学即：学即：-dc/dt=kck=Ae-E/RT又又k=Ae-E/RT当温
28、度从当温度从T1升到升到T2时有时有ln(k2/k1)=E/R(1/T1-1/T2)和和ln(k2/k1)=E/R(1/T1-1/T2)两式相除得两式相除得ln(k2/k1)/ln(k2/k1)=E/E不同温度灭菌时间及培养基破坏情况温度（）灭菌时间（min）营养成分破坏(%)温度（)灭菌时间（min）营养成分破坏(%)10040099.31300.5811030671400.08211515501500.011120427二、分批灭菌二、分批灭菌1、分批灭菌的阶段、分批灭菌的阶段灭菌过程中，灭菌过程中，N/N0是灭菌程度的主要指标，是灭菌程度的主要指标，而而N0是是培养基初始杂菌浓度，培养基
29、初始杂菌浓度，N表示灭菌后的杂表示灭菌后的杂菌浓度，但要求绝对无菌很难做到，但可以这样菌浓度，但要求绝对无菌很难做到，但可以这样定义定义N：灭菌一千罐培养基存活的孢子数为灭菌一千罐培养基存活的孢子数为1。发。发酵罐在进行实罐灭菌时，是典型的分批灭菌过程，酵罐在进行实罐灭菌时，是典型的分批灭菌过程，全过程包括升温、保温、降温三个阶段。全过程包括升温、保温、降温三个阶段。孢子受热死亡规律符合孢子受热死亡规律符合dN/dt=kNlnN/N0=-ktlnN0/N=ln（N0/N1N1/N2N2/N）=lnN0/N1+lnN1/N2+lnN2/N2、分批灭菌的计算、分批灭菌的计算分批灭菌的分批灭菌的T-
30、t过程曲线不是任意给定的，它过程曲线不是任意给定的，它决定于加热方式、换热面积、传热系数，换热介质决定于加热方式、换热面积、传热系数，换热介质的温度及培养基的重量等多种因素。的温度及培养基的重量等多种因素。（1）、灭菌时间的计算）、灭菌时间的计算t=1/klnN0/NLgk=-14845/T+36.127例题：某发酵罐，内装培养基例题：某发酵罐，内装培养基40m3,在在121下进行下进行分批灭菌。设每毫升培养基中含耐热芽孢为分批灭菌。设每毫升培养基中含耐热芽孢为107个，个，求理论灭菌时间？假如培养基从求理论灭菌时间？假如培养基从100升到升到121需要需要20分钟时间，考虑这一阶段的灭菌效果
31、，求灭分钟时间，考虑这一阶段的灭菌效果，求灭菌时间。菌时间。解：解：(1)N0=40106107=41014个个N=0.001个个Lgk=-14845/T+36.127=-14845/394+36.127=-1.55k=0.0281s-1t=1/klnN0/N=1/0.0281ln41014/0.001=1442.6s=24min100110120(2)温度从温度从100升到升到121时微生物由时微生物由N0降到降到Np,k是温度的函数是温度的函数T1kdT=0.128K/sKm=0.128/(394-373)=0.0061s-1Np=N0/(ekmtp)=41014/e0.00612060=
32、2.651011个个从而从而t=19.7min空气空气蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽(2)分批灭菌的操作分批灭菌的操作:分批灭菌在所用的发酵罐分批灭菌在所用的发酵罐中进行。将培养基在配料罐中配制好，通过专用中进行。将培养基在配料罐中配制好，通过专用管道用泵打人发酵罐，开始灭菌。管道用泵打人发酵罐，开始灭菌。一般有空气管路和排气管路，取样用的取样管一般有空气管路和排气管路，取样用的取样管道，放料用的出料管道，接种管道，消沫剂管道，道，放料用的出料管道，接种管道，消沫剂管道，补料管道等。发酵罐传热用的夹套或蛇管，因采补料管道等。发酵罐传热用的夹套或蛇管，因采用间壁传热而与发酵罐内部不相通。用间壁传热而与
33、发酵罐内部不相通。在进行培养基灭菌之前，通常先把发酵罐的空在进行培养基灭菌之前，通常先把发酵罐的空气分过滤器灭菌并用空气吹干。进料完毕后，开气分过滤器灭菌并用空气吹干。进料完毕后，开动搅拌以防料液沉淀。然后开启夹套蒸汽阀，缓动搅拌以防料液沉淀。然后开启夹套蒸汽阀，缓慢引进蒸汽，使料液预热升温至慢引进蒸汽，使料液预热升温至80左右后关闭左右后关闭夹套蒸汽阀门。夹套蒸汽阀门。开开3路路(空气、出料、取样空气、出料、取样)进汽阀，开排气进汽阀，开排气阀，包括小管子阀，包括小管子(进料管、补料管、接种管进料管、补料管、接种管排气阀排气阀)。当升温至。当升温至110左右，控制进出左右，控制进出汽阀门直至
34、汽阀门直至121(表压表压01 MPa)开始保温，开始保温，保温一般为保温一般为30 min。保温结束后，关闭过滤器排气阀、排汽阀、保温结束后，关闭过滤器排气阀、排汽阀、进汽阀。关闭夹套下水道阀，开启冷却水进汽阀。关闭夹套下水道阀，开启冷却水进回水阀。待罐压低于过滤器压力时，开进回水阀。待罐压低于过滤器压力时，开启空气进气阀引入无菌空气。随后引入冷启空气进气阀引入无菌空气。随后引入冷却水，将培养基温度降至培养温度。却水，将培养基温度降至培养温度。3影响培养基灭菌的其他因素影响培养基灭菌的其他因素（1）培养基成分：脂肪、糖类及一定浓度）培养基成分：脂肪、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性
35、。的蛋白质会增加微生物的耐热性。（2）pH:pH6-8，微生物最耐热。微生物最耐热。（3）培养基中的固体颗粒：颗粒小灭菌容）培养基中的固体颗粒：颗粒小灭菌容易，颗粒大灭菌难。易，颗粒大灭菌难。（4）泡沫：因为泡沫传热较难。）泡沫：因为泡沫传热较难。（5）灭菌效果和营养成分的保存灭菌效果和营养成分的保存2（一）连续灭菌的流程（一）连续灭菌的流程1、连续灭菌的优点、连续灭菌的优点（1）培养基的受热时间短，能有效保存营养成分。）培养基的受热时间短，能有效保存营养成分。（2）生产效率高）生产效率高（3）蒸汽用量平稳，但蒸汽压力一玫要求高于）蒸汽用量平稳，但蒸汽压力一玫要求高于5*105Pa(表压表压)
36、。2、缺点（、缺点（1）连续灭菌设备比较复杂，投资较大。）连续灭菌设备比较复杂，投资较大。培养基采用连续灭菌时，培养基采用连续灭菌时，（2）发酵罐应在连续灭菌开始前先进行空罐灭菌，）发酵罐应在连续灭菌开始前先进行空罐灭菌，以容纳经过灭菌培养基。以容纳经过灭菌培养基。（3）灭菌过程中容易出现返混现象。）灭菌过程中容易出现返混现象。三、连续灭菌3、连续灭菌的过程、连续灭菌的过程（1）发酵罐应在连续灭菌开始前先进行空罐灭菌，以）发酵罐应在连续灭菌开始前先进行空罐灭菌，以容纳经过灭菌培养基。加热器、维持罐和冷却器也应先容纳经过灭菌培养基。加热器、维持罐和冷却器也应先进行灭菌，然后才能进行培养基连续灭菌
37、。进行灭菌，然后才能进行培养基连续灭菌。（2）预热：预热可在培养基配制罐或预热罐中进行，预热：预热可在培养基配制罐或预热罐中进行，使培养基的温度升到使培养基的温度升到70左右。左右。（3）加热：在加热器中，培养基与蒸汽混和，温度迅）加热：在加热器中，培养基与蒸汽混和，温度迅速上升到速上升到130140。目前，应用较多的是喷射式加热目前，应用较多的是喷射式加热器，培养基从下方喷嘴的内管进入，蒸汽则从环隙部分器，培养基从下方喷嘴的内管进入，蒸汽则从环隙部分进入，与培养基混和。进入，与培养基混和。（4）保温：）保温：培养基在加热器中被加热到预定的灭菌温培养基在加热器中被加热到预定的灭菌温度后，进入保
38、温设备度后，进入保温设备(也称维持设备也称维持设备)中，经过一段时间中，经过一段时间的保温，使培养基中所含微生物全部杀的保温，使培养基中所含微生物全部杀灭。灭。（5）冷却：在较短的时间内，使温度降到）冷却：在较短的时间内，使温度降到30404、连续灭菌的流体流动模型、连续灭菌的流体流动模型连续灭菌的保温设备有两种形式：一种是罐连续灭菌的保温设备有两种形式：一种是罐式保式保温设备，另一种是管式保温设备。罐式保温温设备，另一种是管式保温设备。罐式保温设备设备是一个直立圆筒形容器，并且附有进料、出料管是一个直立圆筒形容器，并且附有进料、出料管道。培养基的平均停留时间道。培养基的平均停留时间t=V/Q
39、在设计罐式维持设备时，通常取培养基的平均停在设计罐式维持设备时，通常取培养基的平均停留时间为理论值的留时间为理论值的35倍。在灭菌温度为倍。在灭菌温度为130时，实际平均停留时间可取时，实际平均停留时间可取10min在在140，实际平均停留时间可取实际平均停留时间可取3-4minQ,N0Q,NQN0=QNf+KNfV又又V/Q=tNf/N0=1/(1+Kt)在管式维持器中，若培养基流动为活塞流，在管式维持器中，若培养基流动为活塞流，就可按式就可按式lnN/N0=kt求出的灭菌时间求出的灭菌时间(即保即保温时间温时间)，根据管式维持器的内径、培养，根据管式维持器的内径、培养基的流量求出管长。实际
40、上，培养基不可基的流量求出管长。实际上，培养基不可能呈活塞流流动，当培养基处于滞流状态能呈活塞流流动，当培养基处于滞流状态时，管内速度分布呈抛物线，管中心部位时，管内速度分布呈抛物线，管中心部位的最大流速为平均流速的的最大流速为平均流速的2倍。倍。当培养基处于湍流时，中间部分的速度分布较当培养基处于湍流时，中间部分的速度分布较为平坦，最大流速为平均流速的为平坦，最大流速为平均流速的1.22倍，我们倍，我们在设计管式维持器时，若以平均流速确定管长，在设计管式维持器时，若以平均流速确定管长，则会造成边缘部分培养基的过热，为了较好地则会造成边缘部分培养基的过热，为了较好地确定管长，可以采用扩散模型，
41、我们用轴向扩确定管长，可以采用扩散模型，我们用轴向扩散系数散系数Dz来表示液体流动偏离活塞流的程度。来表示液体流动偏离活塞流的程度。Dz=0时，不存在轴向扩散，这时为活塞流。时，不存在轴向扩散，这时为活塞流。Dz越大越偏离活塞流。越大越偏离活塞流。Dz达到无穷大时，流动成达到无穷大时，流动成全混流。全混流。Q=AUdL N0 N N+(dN/dL)dL L=0 L对微元进行衡算，对微元进行衡算，流入的活孢子数流入的活孢子数=流出的流出的+热死掉的热死掉的QN=Q+KNAdL分离变量积分得分离变量积分得lnNf/N0=-Kt与分批灭菌的灭菌时间一样与分批灭菌的灭菌时间一样二、连续灭菌设备二、连续灭菌设备（一）连续灭菌的流程（一）连续灭菌的流程1、罐式灭菌流程、罐式灭菌流程2、薄板式灭菌流程、薄板式灭菌流程（二）连续灭菌的设备（二）连续灭菌的设备1、连消塔连消塔(1)、套管式、套管式结构与原理：结构与原理：(2)、混合式、混合式结构与原理：结构与原理：2喷射加热器喷射加热器料液进料液进口口料液入口料液入口3、维持罐、维持罐(1)、作用、作用(2)、结构、结构(3)、容积及尺寸、容积及尺寸V=v/60/60 取取0.85-0.90.85-0.9 H/D=3-4H/D=3-4排汽排汽