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1、第二章培养基灭菌一、灭菌的概念和必要性一、灭菌的概念和必要性二、灭菌的方法二、灭菌的方法三、培养基灭菌的要求三、培养基灭菌的要求四、液体培养基灭菌的特点四、液体培养基灭菌的特点第一节第一节 概述概述染菌的危害性染菌的危害性灭菌的方法灭菌的方法培养基灭菌的要求培养基灭菌的要求液体培养基灭菌的特点液体培养基灭菌的特点本节知识点：本节知识点：热灭菌原理热灭菌原理重点：重点：微生物的培养过程：微生物的培养过程：培养基配制培养基配制灭菌灭菌接种接种培养培养工程上的灭菌是指用物理或化学因子杀灭有生活能力的细菌工程上的灭菌是指用物理或化学因子杀灭有生活能力的细菌营养体和芽孢或孢子的方法。营养体和芽孢或孢子的
2、方法。消毒是消除病原微生物的措施。消毒是消除病原微生物的措施。在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。工业规模的液体培在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。灭菌的目的：纯种发酵。灭菌的目的：纯种发酵。1.灭菌的定义灭菌的定义用物理或化学因素除去物品上所有生活微生物的方法。用物理或化学因素除去物品上所有生活微生物的方法。一、灭菌的概念和必要性一、灭菌的概念和必要性从字义上来看，消毒就是消除毒害，这里的从字义上来看，消毒就是消除毒害，这里的“毒害毒害”就是就是指传染源或致病菌的意思，英文中的指传染源或致病菌的意思
3、，英文中的“dis-infection”也是也是“消除传染消除传染”的意思。的意思。所以，消毒是一种采用所以，消毒是一种采用较温和的理化因素较温和的理化因素，仅，仅杀死物体杀死物体表面或内部一部分对人体有害的表面或内部一部分对人体有害的病原菌病原菌，而对被消毒的，而对被消毒的物体基本无害的措施。物体基本无害的措施。消毒（消毒（disinfection）灭菌与消毒的区别灭菌灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子消毒消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微
4、生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。（1）低温）低温（2）缺氧）缺氧（3）干燥）干燥（4）高渗）高渗（5）高酸度）高酸度（6）防腐剂）防腐剂防腐（防腐（antisepsis）化疗即化学治疗。它是利用具有高度选择毒力（即对病化疗即化学治疗。它是利用具有高度选择毒力（即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。传染病的一种措施。用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。最重要的化
5、学用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。最重要的化学治疗剂如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中的有效成治疗剂如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中的有效成分等。分等。化疗（化疗（chemotherapy）为什么要进行培养基灭菌？为什么要进行培养基灭菌？由于生物反应系统中通常含有比较丰实的营养物质，容易由于生物反应系统中通常含有比较丰实的营养物质，容易受到杂菌污染，由于杂菌的存在，会有以下各种不良后受到杂菌污染，由于杂菌的存在，会有以下各种不良后果：果：1)生物反应的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产生物反应的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。能力的下降。2)由于杂菌所产生的一些代谢
6、产物改变了发酵液的某些理由于杂菌所产生的一些代谢产物改变了发酵液的某些理化性质，使目标产物的提取困难，造成收得率降低或使化性质，使目标产物的提取困难，造成收得率降低或使产品质量下降。产品质量下降。3)污染的杂菌可能会分解产物，而使生产失效。污染的杂菌可能会分解产物，而使生产失效。4)发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失效。发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失效。2必要性必要性3工业上具体措施工业上具体措施包括：包括：1）使用的培养基和设备须经灭菌；）使用的培养基和设备须经灭菌；2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；3）设备应严密，发酵罐维持正
7、压环境；）设备应严密，发酵罐维持正压环境；4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；）培养过程中加入的物料应经过灭菌；5）使用无污染的纯粹种子。）使用无污染的纯粹种子。4培养基灭菌的目的培养基灭菌的目的杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。1.化学试剂灭菌化学试剂灭菌2.电磁波、射线灭菌电磁波、射线灭菌紫外线、阴极射线、紫外线、阴极射线、X射线、射线、射线射线3.加热灭菌（包括常压或蒸汽高压加热法）加热灭菌（包括常压或蒸汽高压加热法）火焰灭菌、干热灭菌、湿热灭菌火焰灭菌、干热灭菌、湿热灭菌二、灭菌的方法二、灭菌的方法工业上培养基灭菌使
8、用的方法是湿热灭菌。工业上培养基灭菌使用的方法是湿热灭菌。湿热灭菌简便、有效、经济。湿热灭菌简便、有效、经济。常用的化学试剂：常用的化学试剂：氧化剂：氧化剂：0.%0.25%KMnO4溶液、溶液、0.5%1%漂白粉溶液漂白粉溶液醇醛类：醇醛类：75%酒精、酒精、0.25%新洁尔灭、新洁尔灭、10%甲醛溶液、环氧甲醛溶液、环氧乙烷乙烷酚类：苯酚溶液、来苏尔酚类：苯酚溶液、来苏尔1.1.化学药物灭菌化学药物灭菌利用化学试剂对微生物的氧化作用或损伤细胞等利用化学试剂对微生物的氧化作用或损伤细胞等进行灭菌。进行灭菌。利用高能电磁波、紫外线或放射性物质产生的高能利用高能电磁波、紫外线或放射性物质产生的高
9、能粒子射线穿透微生物细胞进行灭菌。粒子射线穿透微生物细胞进行灭菌。紫外线、阴极射线、紫外线、阴极射线、X射线、射线、射线射线2.2.电磁波、射线灭菌电磁波、射线灭菌高温致死原理：由于它使微生物的蛋白质和核酸等重要高温致死原理：由于它使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏，例如它可使核酸发生脱氨、生物高分子发生变性、破坏，例如它可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状处于
10、最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。3.3.加热灭菌加热灭菌主要原理主要原理在一定温度范围内，温度越低，细菌繁殖越慢；温度越在一定温度范围内，温度越低，细菌繁殖越慢；温度越高，繁殖越快。但温度太高，细菌就会死亡。不同的细菌有高，繁殖越快。但温度太高，细菌就会死亡。不同的细菌有不同的最适生长温度和耐热、耐冷能
11、力。不同的最适生长温度和耐热、耐冷能力。巴氏消毒其实就是利用巴氏消毒其实就是利用病原体病原体不是很耐热的特点，用适当的不是很耐热的特点，用适当的温度和保温时间处理，将其全部杀灭。但经巴氏消毒后，仍温度和保温时间处理，将其全部杀灭。但经巴氏消毒后，仍保留了小部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢，因此保留了小部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢，因此巴氏消毒牛奶要在巴氏消毒牛奶要在4左右的温度下保存，且只能保存左右的温度下保存，且只能保存310天，最多天，最多16天。天。现行方法现行方法当今使用的巴氏杀菌程序种类繁多。当今使用的巴氏杀菌程序种类繁多。“低温长时间低温长时间”(LTLT)处理是一
12、个间歇过程，如今只被小型处理是一个间歇过程，如今只被小型乳品厂用来生产一些乳品厂用来生产一些奶酪奶酪制品。制品。“高温短时间高温短时间”(HTST)处理是一个处理是一个“流动流动”过程，通常在过程，通常在板板式热交换器式热交换器中进行，如今被广泛应用于饮用牛奶的生产。通中进行，如今被广泛应用于饮用牛奶的生产。通过该方式获得的产品不是无菌的，即仍含有过该方式获得的产品不是无菌的，即仍含有微生物微生物，且在储，且在储存和处理的过程中需要冷藏。存和处理的过程中需要冷藏。“快速巴氏杀菌快速巴氏杀菌”主要应用于主要应用于生产酸奶乳制品。生产酸奶乳制品。目前国际上通用的巴氏高温消毒法主要有两种：目前国际上
13、通用的巴氏高温消毒法主要有两种：一种是将牛奶加热到一种是将牛奶加热到6265，保持，保持30分钟。采用这一分钟。采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%99.9%，经消毒后残留的只是部分，经消毒后残留的只是部分嗜热菌嗜热菌及耐热性菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌多数是以及芽孢等，但这些细菌多数是乳酸菌乳酸菌，乳酸菌不但对人无，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。害反而有益健康。第二种方法将牛奶加热到第二种方法将牛奶加热到7590，保温，保温1516秒，其杀秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。但杀菌的基本原则是，能将病菌时间更
14、短，工作效率更高。但杀菌的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。主要应用主要应用主要为主要为牛奶牛奶的一种灭菌法，既可杀死对健康有害的病原的一种灭菌法，既可杀死对健康有害的病原菌又可使乳质尽量少发生变化。也就是根据对耐高温性极强菌又可使乳质尽量少发生变化。也就是根据对耐高温性极强的的结核菌结核菌热致死曲线和乳质中最易受热影响的奶油分离性热热致死曲线和乳质中最易受热影响的奶油分离性热破坏曲线的差异原理，在低温下长时间或高温下短时间进行破坏曲线的差异原理，在低温下长时间或高温下短时间进行加热处理的一种方法。其中，在加热处理的一
15、种方法。其中，在60以下加热以下加热30分钟的方式，分钟的方式，作为低温灭菌的标准，早为世界广泛采用。利用高温处理，作为低温灭菌的标准，早为世界广泛采用。利用高温处理，虽对乳质多少有些影响，但可增强灭菌效果，这种方法称为虽对乳质多少有些影响，但可增强灭菌效果，这种方法称为高温灭菌（高温灭菌（sterilization），也就是在），也就是在95以上加热以上加热20分钟。分钟。巴氏灭菌法除牛奶之外，也可应用于巴氏灭菌法除牛奶之外，也可应用于发酵发酵产品。产品。通常，市场上出售的袋装牛奶就是采用巴氏灭菌法生通常，市场上出售的袋装牛奶就是采用巴氏灭菌法生产的。工厂采来鲜牛奶，先进行低温处理，然后用巴
16、氏消产的。工厂采来鲜牛奶，先进行低温处理，然后用巴氏消毒法进行灭菌。用这种方法生产的袋装牛奶通常可以保存毒法进行灭菌。用这种方法生产的袋装牛奶通常可以保存较长时间。较长时间。巴氏消毒法也不是万能的，经过巴氏消毒法处理的牛奶仍巴氏消毒法也不是万能的，经过巴氏消毒法处理的牛奶仍然要储存在较低的温度下（一般然要储存在较低的温度下（一般4），否则还是有变），否则还是有变质的可能性。因此市场上很多出售袋装牛奶的方法是很不质的可能性。因此市场上很多出售袋装牛奶的方法是很不规范的。规范的。巴氏消毒纯鲜奶较好地保存了牛奶的营养与天然风味，巴氏消毒纯鲜奶较好地保存了牛奶的营养与天然风味，在所有牛奶品种中是最好的
17、一种。其实，只要巴氏消毒奶在所有牛奶品种中是最好的一种。其实，只要巴氏消毒奶在在4左右的温度下保存，细菌的繁殖就非常慢，牛奶的左右的温度下保存，细菌的繁殖就非常慢，牛奶的营养和风味就可在几天内保持不变。营养和风味就可在几天内保持不变。利用高温饱和蒸汽将物料的温度升高使微生物体内的蛋白质利用高温饱和蒸汽将物料的温度升高使微生物体内的蛋白质变性进行灭菌。变性进行灭菌。灭菌条件：灭菌条件：121下处理下处理30min多数细菌和真菌的营养细胞在多数细菌和真菌的营养细胞在60左右处理左右处理510min后即可后即可杀死；杀死；酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80以上的温度
18、处理才以上的温度处理才能杀死；能杀死；而细菌的芽孢最耐热，一般要在而细菌的芽孢最耐热，一般要在120下处理下处理15min才能杀死。才能杀死。（2）湿热灭菌法）湿热灭菌法湿热灭菌要比干热灭菌更有效。湿热灭菌要比干热灭菌更有效。a.原生质在含水量高的情况下易变性凝固原生质在含水量高的情况下易变性凝固 b.蒸汽的穿透力强蒸汽的穿透力强湿热灭菌效果：致死温度和致死时间湿热灭菌效果：致死温度和致死时间致死温度：杀灭微生物的极限温度。致死温度：杀灭微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下或以上灭死微生物所需时间。致死时间：在致死温度下或以上灭死微生物所需时间。热阻：微生物在某一特定条件下的死亡时间。热阻
19、：微生物在某一特定条件下的死亡时间。湿热灭菌分：湿热灭菌分：a.分批灭菌分批灭菌 b.连续灭菌连续灭菌间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。养基的灭菌。方法是：将待灭菌的培养基在方法是：将待灭菌的培养基在80100下蒸煮下蒸煮1560分钟，以分钟，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或37下保温过下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻
20、底灭菌的效果。天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。加压加压常规加压灭菌法常规加压灭菌法盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽空盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽空气后将锅密闭，再继续加热至气后将锅密闭，再继续加热至121（压力为（压力为1kgcm2或或15磅英寸磅英寸2），时间维持），时间维持1520分钟，也可采用在分钟，也可采用在较低的温度（较低的温度（115，即，即0.7kgcm2或或10磅英寸磅英寸2）下）下维持维持35分钟分钟的方法。的方法。此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的
21、灭菌。酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。连续加压灭菌法连续加压灭菌法在发酵行业里也称在发酵行业里也称“连消法连消法”。此法只在大规模的发酵。此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。工厂中作培养基灭菌用。主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在135140下处理下处理515秒钟。秒钟。连续加压灭菌法优点连续加压灭菌法优点因采用因采用高温瞬时灭菌高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料
22、的利用率，比度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率，比“实罐灭菌实罐灭菌”（120，30分钟）提高产量分钟）提高产量510；由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所以由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所以缩短了缩短了发酵罐的占用周期发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率；，从而提高了它的利用率；由于由于蒸汽负荷均匀蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；，故提高了锅炉的利用率；适宜于适宜于自动化自动化操作；操作；降低降低了操作人员的了操作人员的劳动强度劳动强度。高温对培养基成分的有害影响及其防止高温对培养基成分的有害影响及其防止消除高温有害影响的措施消除高温有害影响的措施（1）采用特殊加
23、热灭菌法）采用特殊加热灭菌法（2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；其他成分分别灭菌后再合并；（3）对含）对含Ca2+或或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在培养基）可进行低压灭菌（在112即即0.57kgcm2或或8磅英寸磅英寸2下灭菌下灭菌15分钟）或间歇灭菌；分钟）或间歇灭菌；（5）在大规
24、模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌培养基的灭菌 灭菌设备灭菌设备l、高压蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌生产中使用高压蒸汽灭菌锅的型号很多生产中使用高压蒸汽灭菌锅的型号很多手提式灭菌锅，容量小，多用于某种培养基灭菌。手提式灭菌锅，容量小，多用于某种培养基灭菌。立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培种培养基立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培种培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽培种培养灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽培种培养基的灭菌，一次能装几百至
25、几千瓶基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋袋)。但投资太大，适。但投资太大，适合大型菌种场使用。合大型菌种场使用。立式灭菌锅立式灭菌锅2、常压蒸汽灭菌锅、常压蒸汽灭菌锅常压蒸汽灭菌锅是用铁锅、砖、水常压蒸汽灭菌锅是用铁锅、砖、水泥砌成的，造价低，适于一般生产单位和专业户使用。泥砌成的，造价低，适于一般生产单位和专业户使用。大小可根据需要而定，但最大的锅每次装料也最好不大小可根据需要而定，但最大的锅每次装料也最好不超过超过500公斤。公斤。3、烘箱、烘箱烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和灭菌，也可烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和灭菌，也可用于其它物品烘干。用于其它物品烘干。三、培养基灭菌的要求三、培养基
26、灭菌的要求培养基灭菌程度：因发酵系统而不同培养基灭菌程度：因发酵系统而不同（1）达到要求的无菌程度（即可以接受的范围）达到要求的无菌程度（即可以接受的范围）（2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。分如氨基酸和维生素等的分解。培养基灭菌需解决的问题：培养基灭菌需解决的问题：灭菌的温度灭菌的温度 灭菌的时间灭菌的时间四、发酵工业培养基灭菌
27、的特点四、发酵工业培养基灭菌的特点数量多数量多含有很多固体物质含有很多固体物质有利于生产菌的生长有利于生产菌的生长方便易行价格便宜方便易行价格便宜培养基灭菌应采用高温蒸汽灭菌培养基灭菌应采用高温蒸汽灭菌湿热灭菌湿热灭菌湿热灭菌的优点湿热灭菌的优点蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有很大的潜热；蒸汽有很大的潜热；操作方便，易管理。操作方便，易管理。培养基湿热灭菌需解决的工程问题培养基湿热灭菌需解决的工程问题将培养基中的杂菌总数将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数杀灭到可以接受的总数N
28、（10-3），需要多高的温度、多长的时间为合理。），需要多高的温度、多长的时间为合理。灭菌温度和时间的确定取决于：灭菌温度和时间的确定取决于：杂菌孢子的热死灭动力学杂菌孢子的热死灭动力学反应器的形式和操作方式反应器的形式和操作方式培养基中有效成分受热破坏的可接受范围培养基中有效成分受热破坏的可接受范围 第二节第二节加热灭菌的基本原理加热灭菌的基本原理一、相关概念一、相关概念二二、微生物的热死原理微生物的热死原理对数残存定律对数残存定律三、灭菌温度与菌反应速度常数的关系三、灭菌温度与菌反应速度常数的关系四、影响培养基灭菌的因素四、影响培养基灭菌的因素 本节知识点：本节知识点：致死温度、致死时间、
29、热阻致死温度、致死时间、热阻微生物的热死原理微生物的热死原理对数残存定律对数残存定律菌温度与菌反应速度常数的关系菌温度与菌反应速度常数的关系影响培养基灭菌的因素影响培养基灭菌的因素重点：对数残存定律重点：对数残存定律难点：灭菌温度与反应速度常数的关系难点：灭菌温度与反应速度常数的关系 一、相关概念一、相关概念致死温度：杀死微生物的极限温度。致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下杀死全部微生物所需要的时间。致死时间：在致死温度下杀死全部微生物所需要的时间。微生物对热的抵抗力用微生物对热的抵抗力用“热阻热阻”表示。热阻指微生物在表示。热阻指微生物在某一条件下的致死时间。某一条件下的
30、致死时间。营养细胞和细菌芽孢对热的抵抗力不同。营养细胞和细菌芽孢对热的抵抗力不同。相对热阻：在相同条件下两种微生物热阻的比值。相对热阻：在相同条件下两种微生物热阻的比值。二、微生物的热死灭动力学方程二、微生物的热死灭动力学方程湿热蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，湿热蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。可逆的凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。由于湿热灭菌有经济和快速等特点，因此被广泛用于工由于湿热灭菌有经济和快速等特点，因此被广泛用于
31、工业生产。业生产。用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求是要求是:既要达到一定的灭菌程度，既要达到一定的灭菌程度，又要尽量减少营又要尽量减少营养成分养成分的破坏。的破坏。微生物的热死原理微生物的热死原理对数残存定律对数残存定律对数残存定律对数残存定律热死灭动力学方程热死灭动力学方程某些分子的分解和分子内部的重新排列的反应属于单分子某些分子的分解和分子内部的重新排列的反应属于单分子反应。杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但其受热被杀反应。杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但其受热被杀死，主要原因是高温能使蛋白质变性，这种反应属与单分死，主要原因是高温能使蛋白质变性，这种反应
32、属与单分子反应。故在一定温度下，微生物受热死亡符合子反应。故在一定温度下，微生物受热死亡符合单分子反单分子反应动力学应动力学。在灭菌过程中，活菌逐渐减少，其减少量随残。在灭菌过程中，活菌逐渐减少，其减少量随残存活菌数的减少而逐减，即微生物热死亡速率与任一瞬间存活菌数的减少而逐减，即微生物热死亡速率与任一瞬间残存活菌数成正比，即对数残存定律：残存活菌数成正比，即对数残存定律：死亡速率死亡速率残存活菌数残存活菌数灭菌时间（灭菌时间（minmin）热死速度常数（杀菌速度常数）热死速度常数（杀菌速度常数）与菌的种类和加热温度有与菌的种类和加热温度有关（关（min-1）。是判断微生）。是判断微生物受热死
33、亡难易程度的基物受热死亡难易程度的基本依据。本依据。K值俞小，则此值俞小，则此微生物俞耐热。微生物俞耐热。N0-灭菌开始灭菌开始(t=0)时，原有活菌数（污染度时，原有活菌数（污染度)N-经过灭菌时间经过灭菌时间t后残存活菌数后残存活菌数积分将存活率与灭菌时间将存活率与灭菌时间t在半对数坐标纸上标会在半对数坐标纸上标会可以得到直线。直线的斜率为可以得到直线。直线的斜率为K，K值越大值越大表示微生物越容易死亡。表示微生物越容易死亡。存活率存活率T一定，一定，K随微生物种类不同而不同。随微生物种类不同而不同。如，在如，在121，枯草芽胞杆菌，枯草芽胞杆菌FS5230的的K：0.0470.063s-
34、1；梭状芽胞杆菌；梭状芽胞杆菌PA3679的的K：0.03s-1；嗜热脂肪杆；嗜热脂肪杆菌菌FS1518的的K：0.013s-1。同一种微生物，营养细胞和芽胞的同一种微生物，营养细胞和芽胞的K值也有很大的差别，值也有很大的差别，营养细胞易于受热死亡营养细胞易于受热死亡，K值很高。值很高。120灭菌灭菌K值可大值可大致为致为1010（min-1）数量级，而细菌孢子的）数量级，而细菌孢子的K值在值在120只只有有100数量级。表数量级。表2-1。三、比热死亡速率常数三、比热死亡速率常数1、微生物的种类、微生物的种类K=f（菌种，温度）（菌种，温度）实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的实验
35、还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过120C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。判断题判断题对于同一种细菌，它的K（比热死亡速率常数（比热死亡速率常数)是固定的。是固定的。细菌孢子的比热死亡速率常数比营养细胞的大。细菌孢子的比热死亡速率常数比营养细胞的大。温度越高，细菌的比热死亡速
36、率常数越低。温度越高，细菌的比热死亡速率常数越低。1/101/10衰减时间衰减时间D D值：值：活活得得微微生生物物在在受受热热过过程程中中减减少少到到原原来来数数目目的的1/10 1/10(N/N(N/N0 0=1/10)=1/10)所需要的时间。即有所需要的时间。即有D D与与K K成反比。成反比。Arrhenius方程方程:K=Ae-E/RT或或lnK=-E/RT+lnAE活活化化能能（J/mol），其其值值俞俞大大，k值值越越低低，微微生生物物不不易死亡易死亡K菌死亡的速度常数（菌死亡的速度常数（1min），），A阿阿累累尼尼乌乌斯斯常常数数，也也称称频频率率因因子子（1min），因因
37、菌菌种不同而异种不同而异R气体常数（气体常数（8.36JK.mol）T绝对温度（绝对温度（K）（273.15）2灭菌温度与灭菌温度与K的关系的关系E活化能（活化能（J/mol）。）。1.其值俞大，其值俞大，k值越低，微生物不易死亡。值越低，微生物不易死亡。2.不同菌的活化能不同。不同菌的活化能不同。3.两边取对数得：两边取对数得：对ln K=E/RT+ln A 两边求T的导数 =，和E的关系：E越大，越大细菌孢子热死灭反应的细菌孢子热死灭反应的E很高，而大部分营养物质热破坏很高，而大部分营养物质热破坏反应的反应的E很低，因而将很低，因而将T提高到一定程度会加速细菌孢子的提高到一定程度会加速细菌
38、孢子的死灭速率，从而缩短在升高温度下的灭菌时间（死灭速率，从而缩短在升高温度下的灭菌时间（ln(N/N0)=Kt）；由于营养成分热破坏的）；由于营养成分热破坏的E很低，上述的温度提高很低，上述的温度提高只能稍微增大其热破坏温度，但由于灭菌时间的显著缩短，只能稍微增大其热破坏温度，但由于灭菌时间的显著缩短，结果是营养成分的破坏量在允许的范围内。结果是营养成分的破坏量在允许的范围内。1、营养成分的保持、营养成分的保持培养基成分受热分解的反应也属一级反应，符合对培养基成分受热分解的反应也属一级反应，符合对数残存定律和阿氏方程：数残存定律和阿氏方程：K营养物破坏的反应速率常数（营养物破坏的反应速率常数
39、（min-1）C营养物浓度（营养物浓度（mol/L）E营养物分解反应的活化能（营养物分解反应的活化能（J/mol）四、影响培养基灭菌的因素四、影响培养基灭菌的因素通通常常E比比E大大很很多多。化化学学反反应应动动力力学学指指出出：在在活活化化能能大大的的反反应应中中，反反应应速速率率随随温温度度变变化化也也大大。故故当当温温度度升升高高时时，杂杂菌菌死死亡亡速速率率要要比比营营养养成成分分破破坏坏速速度度快快得得多多。故采用故采用HTST方法，可以减少营养成分破坏。方法，可以减少营养成分破坏。灭菌的目的：有效杀灭杂菌，同时尽可能降低对灭菌的目的：有效杀灭杂菌，同时尽可能降低对营养的破坏程度。营
40、养的破坏程度。2 2、微生物的耐热性、微生物的耐热性 3 3、pHpH值值4 4、培养基成分、培养基成分5 5、泡沫、泡沫6 6、颗粒、颗粒嗜热脂肪芽胞杆菌孢子和维嗜热脂肪芽胞杆菌孢子和维生素生素B1的热处理数据（一定的热处理数据（一定T下，下，ln(N/N0)=Kt），），就不同的就不同的T，求得前者的比热，求得前者的比热死亡速率常数死亡速率常数KBS和后者的比和后者的比破坏速率常数破坏速率常数KVB，按，按lnK1/T标会，得图，标会，得图，分批灭菌的例题分批灭菌的例题由图算出：由图算出：EBS=670004.184J/molEVB=220004.184J/mollnK=-E/RT+lnA
41、根据上图，若把灭菌温度从根据上图，若把灭菌温度从105（1/T=2.6410-3）提高到提高到127（1/T=2.5010-3），则），则KVB从从0.02min-1增大增大到到0.06min-1，KBS从从0.12增大到增大到40.0min-1，也就是说，灭，也就是说，灭菌温度提高了菌温度提高了22，嗜热脂肪芽胞杆菌孢子的比热死亡，嗜热脂肪芽胞杆菌孢子的比热死亡速率增大速率增大330倍，而维生素倍，而维生素Bd比热死亡速率仅仅增加了比热死亡速率仅仅增加了3倍。倍。培养基灭菌的工程设计无菌的标准无菌的标准根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌是根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌
42、是很难做到的，也是不必要的。因此在工程设计中常取很难做到的，也是不必要的。因此在工程设计中常取N=10-3一、分批灭菌的操作一、分批灭菌的操作二、基础条件的确定二、基础条件的确定三、三、灭菌效率的计算灭菌效率的计算四、分批灭菌的讨论四、分批灭菌的讨论第三节第三节 分批灭菌的设计计算分批灭菌的设计计算分批灭菌的操作过程分批灭菌的操作过程分批灭菌时间的计算分批灭菌时间的计算操作时间的计算操作时间的计算本节知识点本节知识点重点：分批灭菌的操作和计算重点：分批灭菌的操作和计算难点：分批灭菌的操作和计算难点：分批灭菌的操作和计算一、分批灭菌的操作一、分批灭菌的操作间歇灭菌（实罐灭菌、实消）间歇灭菌（实罐
43、灭菌、实消）将配好的培养基打入发酵罐，通入蒸汽将培养基和所用将配好的培养基打入发酵罐，通入蒸汽将培养基和所用的设备（一般是发酵罐）一起进行灭菌，也称实罐灭菌。的设备（一般是发酵罐）一起进行灭菌，也称实罐灭菌。这种方法不需专门的灭菌设备，在发酵罐中进行，灭菌这种方法不需专门的灭菌设备，在发酵罐中进行，灭菌效果可靠。分批灭菌对蒸汽的压力要求较低，在效果可靠。分批灭菌对蒸汽的压力要求较低，在34105Pa（表压）就可满足要求，但在灭菌过程中，蒸（表压）就可满足要求，但在灭菌过程中，蒸汽用量波动大，造成锅炉负荷波动大。汽用量波动大，造成锅炉负荷波动大。在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包
44、在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程。括升温、保温、降温三个过程。间歇灭菌的优缺点间歇灭菌的优缺点优点：优点：1.设备投资较少设备投资较少2.染菌的危险性较小染菌的危险性较小3.人工操作较方便人工操作较方便4.对培养基中固体物质含量较多时更为适宜对培养基中固体物质含量较多时更为适宜缺点：灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，缺点：灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。一般只限于中小型发酵装置。保证间歇灭菌成功的要素保证间歇灭菌成功的要素内部结构合理内部结构合理(主要是无死角主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠，焊缝
45、及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象蛇管无穿孔现象压力稳定的蒸汽压力稳定的蒸汽合理的操作方法合理的操作方法。发酵罐的接管图发酵罐的接管图发酵罐的接管图发酵罐的接管图二、基础条件的确定二、基础条件的确定1、污染度、污染度N0一般假定位一般假定位104106个个/ml2、灭菌度、灭菌度N实际计算时取实际计算时取N10-3，即处理，即处理1000只有一个只有一个或微生物（一般是针对周期长，成本高的发酵）。或微生物（一般是针对周期长，成本高的发酵）。3、N/N0为灭菌程度的指标为灭菌程度的指标。例如：培养基例如：培养基100m3，含菌，含菌105个个/ml,，要求灭菌后存活菌数，要求灭菌后存活菌数10-3个
46、个/罐，则罐，则N0/N=(100106105/10-3)=1016，为计算，为计算方便，取方便，取ln(N0/N)=36.8分批灭菌过程：升温、保温和降温，灭菌主要是在保温过程分批灭菌过程：升温、保温和降温，灭菌主要是在保温过程中实现的，在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度中实现的，在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度很高，因而对灭菌也有一定贡献。很高，因而对灭菌也有一定贡献。LnN0/N=36.8是总的判据，是由升温、保温、是总的判据，是由升温、保温、降温三段实现的。降温三段实现的。4、污染菌的热死特性、污染菌的热死特性要了解是否符合对数残留定律，确定要了解是否符合对数残留定律，确定K
47、，A，E的值。的值。对不同细胞，选取不同的对不同细胞，选取不同的T和和t。5、培养罐中温度与时间的关系、培养罐中温度与时间的关系大量培养液分批灭菌时，加热和冷却时大量培养液分批灭菌时，加热和冷却时间不能忽略。间不能忽略。总灭菌时间等于升温、保温和降温三段时间之和。总灭菌时间等于升温、保温和降温三段时间之和。t=t1+t2+t3三、灭菌效率的计算三、灭菌效率的计算若灭菌温度恒定为若灭菌温度恒定为T，那么到规定灭菌度（，那么到规定灭菌度（N）所需杀菌时间所需杀菌时间当灭菌当灭菌随时间变化时，随时间变化时，K也变化，则有也变化，则有积分积分 用用V表示灭菌效果，则有表示灭菌效果，则有 V总总ln(N
48、0/NS)=V加加+V保保+V冷冷升温、维持和冷却过程中灭菌效果分别为升温、维持和冷却过程中灭菌效果分别为V加加V保保V冷冷加热和冷却后积分，简化得公式，加热和冷却后积分，简化得公式，P146页页例如：某发酵罐分批灭菌最高温度例如：某发酵罐分批灭菌最高温度120，保持，保持5min，设计的温度和时间关系如下：发酵罐设计的温度和时间关系如下：发酵罐100m3，N0=105个个/ml，N=10-3，已知升温和冷却的灭菌效果不超过总灭菌，已知升温和冷却的灭菌效果不超过总灭菌效果的效果的25%，问设计的，问设计的T-t过程是否达到灭菌要求，如不过程是否达到灭菌要求，如不能，应如何改进？（能，应如何改进
49、？（A=7.941038min-1；E=278441J/mol;R=8.28J/molK）实际生产上，培养基直接蒸汽加热和间接冷却的计算。实际生产上，培养基直接蒸汽加热和间接冷却的计算。P12工业规模的灭菌操作，完成整个灭菌周期的时间是工业规模的灭菌操作，完成整个灭菌周期的时间是35h，各阶段的贡献大致如下：各阶段的贡献大致如下：V加加/V总总=0.2V保保/V总总=0.75V冷冷/V总总=0.05四、分批灭菌的讨论四、分批灭菌的讨论温度和压力的关系泡沫问题投料过程中，麸皮和豆饼粉等固形物在罐壁上残留的问题灭菌结束后应立即引入无菌空气保压培养基间歇灭菌过程中应注意的问题一、连续灭菌概念一、连续
50、灭菌概念二、连续灭菌流程二、连续灭菌流程三、连续灭菌计算三、连续灭菌计算四四.连续灭菌反应器的流体流动模型连续灭菌反应器的流体流动模型第四节第四节 连续灭菌及其计算连续灭菌及其计算连续灭菌的工作原理连续灭菌的工作原理连续灭菌的工艺流程连续灭菌的工艺流程连续灭菌时间的计算连续灭菌时间的计算连续灭菌反应器设备及计算连续灭菌反应器设备及计算本节知识点：本节知识点：重点：连续灭菌的工艺流程、重点：连续灭菌的工艺流程、设备及计算设备及计算难点：连续灭菌计算及应用难点：连续灭菌计算及应用一、连续灭菌概念一、连续灭菌概念连续灭菌（连消）：连续灭菌（连消）：培养基在罐外连续进行加热、维培养基在罐外连续进行加热