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1、蔗糖酶米氏常数的测定蔗糖酶米氏常数的测定【目的目的】：了解底物浓度与酶反应速度间的关系，：了解底物浓度与酶反应速度间的关系，学习求蔗糖酶米氏常数的方法学习求蔗糖酶米氏常数的方法【原理原理】：米氏方程式：米氏方程式 v=VmaxS Km+S 式中，式中，Vmax为最大反应速度，为最大反应速度，Km为米氏为米氏常数。常数。米氏常数的求法很多，最常用的是米氏常数的求法很多，最常用的是LineweaVerBurk的作图法的作图法(双倒数作图法双倒数作图法)。将米氏方程式改写为下列倒数形式：将米氏方程式改写为下列倒数形式：1V=KmVmax1S+1Vmax实验时，选择不同的实验时，选择不同的s，测定相应
2、的，测定相应的v，求出两者，求出两者的倒数，以的倒数，以1/s为横坐标，以为横坐标，以1/吉为纵坐标作图，吉为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至横轴相交，横轴截距即为绘出一条直线，外推至横轴相交，横轴截距即为-1/Km。【仪器与试剂仪器与试剂】1.仪器：分光光度计、恒温水浴、试管、吸管、秒表、坐标纸2试剂标准葡萄糖溶液（1mg/ml）、0.2 molL蔗糖溶液、0.2 molL NaAc缓冲溶液(pH4.6)、.1molL NaOH溶液3，5一二硝基水杨酸试剂。【操作步骤操作步骤】1葡萄糖标准曲线的制定葡萄糖标准曲线的制定管号管号012345葡萄糖标准液/ml 00.20.40.60.81.0相
3、当葡萄糖量/mg 00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml2.01.81.61.41.21.03,5二硝基水杨酸试剂/ml3.03.03.03.03.03.0将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用，取出后立即用冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至25ml，摇匀。测，摇匀。测540nm处处A值。以葡萄糖含量（值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，）为横坐标，A值为纵坐标作出标值为纵坐标作出标准曲线。准曲线。取试管8支，按18编号,按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入8支试管中，于37水浴中保温10min。取一定量酶液，放
4、入同一水浴中保温约10min。于各管中依次按同样时间间隔(0.5min或1min)加人已保温过的酶液1.0mL，计时，立即摇匀，在37水浴中作用5min。按同样次序和时间间隔，加入5mL 1molL NaOH，摇匀，终止反应。吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂和1.0mL水的试管中，都放入沸水浴中加热5min，冷却后稀释至25mL，摇匀，在540nm比色测定A值。以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/S为横坐标，1/v为纵坐标作图，由图求出Km值。2底物浓度和初速度底物浓度和初速度测定测定反应物活力测定数据处理管号0.2molL蔗糖液(ml)醋酸缓冲液(ml)酶液(ml)1molLNaOH(ml_)吸取反应物(ml)水杨酸试剂(ml)水(ml)A540 底物浓度1/s(1/M)1/1234567800.51.01.52.02.53.755.05.04.54.03.53.02.51.2501.01.01.01.01.01.01.01.05.05.05.05.05.05.05.05.01.01.01.01.01.01.01.01.03.03.03.03.03.03.03.03.01.01.01.01.01.01.01.01.0【实验结果与讨论实验结果与讨论】