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1、实验十四实验十四 碱性磷酸酶米氏常碱性磷酸酶米氏常数的测定数的测定一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km和Vm值。二、原理二、原理酶促反应v-S曲线vS推导出米氏方程为：其中S为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km为米氏常数米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定Km和Vm，可通过作图法求得。最常用的Lineweaver-Burk双倒数
2、作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v对1/S作图，可得一条直线1/v1/Vm-1/Km1/S本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm.反应式：pNPP+H2OpNP+HPO42-无色黄色可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。三、试剂与器材三、试剂与器材试剂：0.5mol/mLpNP、10mmol/LpNPP、20mmol/LMgCl2、0.1mol/L碳酸钠碳酸氢钠pH10.1缓冲液、0.2mol/LNaOH、6 g/mL碱性磷酸酶酶液器材：恒温水浴锅、722分光光度计四、操作方法四、操作方法（一）对硝基苯酚标准曲线的制作（不做不
3、做）取5支试管编号,0号一支,17号各二支,按下表操作：管号0123456pNP含量(mol)00.050.100.150.200.250.300.5mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.6H2O(mL)0.80.70.60.50.40.30.2Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL0.2mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mLOD405nm以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。(二）测定15支试管，1-5做两组平行测定管，
4、01-05作为空白对照。No.12345底物终浓度S(mM)0.50.751.01.5310mmol/LpNPP（mL）0.10.150.20.30.6蒸馏水（mL）0.60.550.50.40.1碳酸盐缓冲液（mL）各加1.0mL20mmol/LMgCl2（mL）各加0.2mL预热混匀，37，5分钟酶液（mL）测测定管定管各加0.1mL酶液反应时间37，精确反应10分钟0.2mol/LNaOH（mL）各加2mL酶液（mL）空白管空白管各补加0.1mL酶液OD405分别以01-05调零点，测定对应样品管OD405。（三）数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)
5、。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量，计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/S作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。五、注意事项1.取液量一定要准确（移液管或取液器的使用）。2.反应时间一定要精确。3.加酶前后一定要将试剂混匀。4.空白对照一定要先加NaOH，后加酶。5.测定OD405时要以各自的空白调零点。6.不要直接把测定完的样品溶液倒掉，而要倒回原试管。7.比色杯的使用8.底物pNPP要按需取用。9.如果测定值太小或者太大超出量程，要适当调整加如果测定值太小或者太大超出量程，要适当调整加酶的体积或者酶浓度重新进行实验酶的体积或者酶浓度重新进行实验。六、思考题六、思考题(1)试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。(2)为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？